[发明专利]一种烟叶醇化过程中微生物群落演替的分析方法

说明书

一种烟叶醇化过程中微生物群落演替的分析方法，属于环境微生物技术领域。本发明为了明确烟叶醇化过程中微生物种群结构和其动态变化以及微生物基因功能预测，提供一种烟叶醇化过程中微生物群落演替的分析方法，包括如下步骤：1)取样：将自然醇化的烟叶样品，从醇化开始，间隔相同时间进行取样；2)构建基因文库：提取每个时间段采集的样品的基因组DNA，分别构建16S rRNA基因文库和内转录间区基因文库；3)分别对步骤2)中构建的基因文库数据进行分析，得出烟叶醇化过程中微生物群落演替规律。本发明可用于指导人工醇化烟草以及建立微生物菌群。

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种烟叶醇化过程中微生物群落演替的分析方法。

背景技术

烟叶原料在刚收获后，内在品质存在着不同程度的缺陷，如生青味重、刺激性大、烟气粗糙、烟香味被杂气掩盖，另外还会存在苦、辣、涩等不良感受，不能直接用于制造卷烟，必须进行适当的醇化处理。烟叶发酵方法主要有人工醇化、自然醇化两种。自然醇化是一种缓慢的自然发酵过程。人工醇化是指人为的控制温度和相对湿度，加速烟叶上微生物的生长变化、酶促反应及其他物质与烟草之间的化学变化，促使烟叶品质在短时间内得到改善。自然醇化工艺简单，操作方便，发酵后烟叶色泽鲜艳，吸食品质好，但耗时长，需要占用大量空间，占压资金多、生产成本高，并且由于存放时间过长，烟叶容易霉变生虫，造成烟叶损失；目前人工醇化技术，大多仅是涉及到人为控制温度和湿度，对醇化相关的菌株的应用极其匮乏，效果也不尽理想。其主要原因是，烟叶醇化过程是一个微生物演替生长的过程，目前的研究多集中在对醇化过程中的微生物分离和生物酶制剂对醇化的作用上，自然醇化的烟叶作为一个微生物宝库，微生物群落多样性及丰富度较高，并在香气物质的产生和有毒有害物质的降解方面具有极大的优势。但目前缺乏对烟叶醇化过程中微生物菌群结构及动态变化方面的研究和认知。

发明内容

本发明为明确烟叶醇化过程中微生物种群结构和其动态变化以及微生物基因功能预测，提供了一种烟叶醇化过程中微生物群落演替的分析方法，包括如下步骤：

1)取样：将自然醇化的烟叶样品，从醇化开始，间隔相同时间进行取样；

2)构建基因文库：提取每个时间段采集的样品的基因组DNA，分别构建16SrRNA基因文库和内转录间区基因文库；

3)分别对步骤2)中构建的基因文库数据进行分析，得出烟叶醇化过程中微生物群落演替规律。

进一步地限定，步骤1)所述自然醇化的烟叶包括自然醇化的烤烟烟叶以及自然醇化的雪茄烟叶。

进一步地限定，步骤1)所述取样，是指自然醇化2-3年的烟叶从醇化开始每隔2～3个月取一次样。

进一步地限定，步骤2)所述16S rRNA基因文库构建所用的上游引物为799F，其序列如SEQ ID No.1所示，下游引物为1193R，其序列如SEQ ID No：2所示。

进一步地限定，步骤2)所述内转录间区基因文库构建所用的上游引物为ITS1-1F-F，其序列如SEQ ID No.3所示，下游引物为ITS1-1F-R，其序列如SEQ ID No：4所示。

进一步地限定，步骤3)所述分析包括自然醇化的烟叶中细菌和真菌的群落组成分析以及基因功能分析。

进一步地限定，步骤3)所述分析是指先利用QIIME软件对基因文库中序列进行提取后，利用UCLUST将序列分类，再利用Usearch版本8.0鉴定和去除嵌合序列，16S rRNA基因使用UCLUSTSliva数据库进行比对，进行物种注释，内转录间区基因使用UNITE数据库进行比对，进行物种注释，最后细菌利用PICRUSt预测基因的功能，真菌使用FunGuild预测基因的功能。

本发明提供的烟叶醇化过程中微生物群落演替的分析方法得出的演替规律可用于人工醇化烟草中以及建立微生物促烟叶醇化菌库。