[发明专利]一种用于分离培养兔胚胎干细胞的培养液和方法

权利要求书

1.一种用于分离培养兔胚胎干细胞的组合物，其特征在于，所述组合物由碱性成纤维生长因子bFGF、白血病抑制因子LIF、GSK3抑制剂CHIR99021和β-catenin特异性抑制剂XAV-939组成；

所述组合物中bFGF、LIF、CHIR99021、XAV-939的终浓度比为(4～6ng/mL)：(9～11ng/mL)：(2.5～3.5μM)：(1.5～2.5μM)。

2.一种用于分离培养兔胚胎干细胞的培养液，其特征在于，每50mL培养液由以下组分组成：37mLKnockOutDMEM培养液，7.5mL血清替代物，2.5mL胎牛血清，0.5mL青链霉素，0.5mL非必需氨基酸，0.5mL谷氨酸，0.5mLL-谷氨酰胺，0.5mLβ-巯基乙醇，0.5mL核苷，终浓度为4～6ng/mL的bFGF，终浓度为9～11ng/mL的LIF，终浓度为2.5～3.5μM的CHIR99021，终浓度为1.5～2.5μM的XAV-939。

3.根据权利要求2所述培养液，其特征在于，所述培养液中bFGF、LIF、CHIR99021、XAV-939的终浓度分别为4ng/mL、10ng/mL、3μM、2μM。

4.一种分离培养兔胚胎干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用机械分离法处理兔囊胚，每个囊胚分离得到的整个ICM接种到含有权利要求2或3任一所述培养液的饲养层中，于37℃、5％CO₂、相对湿度95％的条件下培养，原代培养4.31～5.63天；之后采用ReLeSR消化法进行克隆传代，即得兔胚胎干细胞。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述机械分离法的步骤为先用链蛋白酶消化囊胚，去除胚胎的粘蛋白和透明带；再将ICM与滋养层细胞分离，然后将ICM吸出转移至饲养层中。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述ReLeSR消化法的处理时间为4～6min。

7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述ReLeSR消化法的步骤为：弃去兔胚胎干细胞培养液，用PBS洗2次，加入适量ReLeSR进行消化1min；吸走多余的消化液，留少量液体没过细胞，放入培养箱中孵化3～5min；加入新的0.5mL兔胚胎干细胞培养液终止消化，将液体转移至EP管；加0.5mL的PBS清洗消化孔，将PBS也转移至EP管；离心1000rpm3min，弃掉上清液，留底部细胞沉淀；加入适量兔胚胎干细胞培养液，吹打使细胞沉淀重悬，按1×10⁵～2×10⁵/mL细胞数量将液体转移至有新饲养层的24孔板中或12孔板，摇晃混匀，放入培养箱中培养，进行下一次消化传代。

8.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述ReLeSR消化法的步骤为：在显微镜下先挑取形态较好克隆，转移至含有100μLReLeSR液体的96孔板中，放置培养箱中消化3～5min；消化完后轻轻将克隆吹打松散，将液体转移到EP管，补充900μL兔胚胎干细胞培养液；离心1000rpm3min，弃掉上清液，留底部细胞沉淀；加入适量兔胚胎干细胞培养液，吹打使细胞沉淀重悬，按1×10⁵～2×10⁵/mL细胞数量将液体转移至有新饲养层的24孔板中或12孔板，摇晃混匀，放入培养箱中培养，进行下一次消化传代。