[发明专利]一种用于分离培养兔胚胎干细胞的培养液和方法

说明书

本发明公开了一种用于分离培养兔胚胎干细胞的培养液和方法。所述培养液包括一种用于分离培养兔胚胎干细胞的组合物，所述组合物由bFGF、LIF、CHIR99021和XAV‑939组成。培养液中添加bFGF、LIF、CHIR99021、XAV939可维持rbESCs的多能性，所培养出的rbESCs形态与小鼠胚胎干细胞克隆类似，呈“岛”状凸起生长，立体感强，且具有部分原始态多能性，经过胰酶消化传代后仍能形成单克隆。此外，培养出的rbESCs能表达更高水平的干细胞多能性相关基因，并兼具有Naïve态和Primed态干细胞的特征分化能力，并能在该培养液中进行长期体外传代培养，可传代至14代。

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体地，涉及一种用于分离培养兔胚胎干细胞的培养液和方法。

背景技术

兔是一种常用的实验室动物，其容易饲养，价格便宜，繁殖周期短，产仔数多，早已用于生物医学研究。兔子体积比鼠大，实验操作方便，使得手术更容易、更有效的获得大样本。在生物医药上，家兔被广泛地用于生物医学的急性实验、内分泌实验、物质代谢实验、药理学实验等方面。在人类疾病应用上，家兔在进化上相对啮齿动物更接近人类。人类疾病在兔子上表现出的病因比在小鼠上更相似，转基因兔又是遗传性和获得性人类疾病的优良动物模型，因而家兔大量的用作治疗人类疾病的实验模型：如糖尿病、肥厚型心肌病、高血压、动脉粥样硬化、高脂血症、脂蛋白代谢紊乱、视网膜退化、肺损伤、炎症疾病等。兔的另一个优点是在生殖技术方面作为一个经典的实验室物种。在超速排卵，体外受精、精子注射、精液冷冻保存、卵子和胚胎冷冻保存、原核显微注射、核移植克隆等方面，兔都有着作为实验动物的显著优越性。因此，来源于兔囊胚ICM的兔胚胎干细胞(Rabbit Embryonic StemCells，rbESCs)的研究也受到重视，如果能获得rbESCs用于人类疾病的研究、生产转基因兔，测试干细胞疗法、基因靶向技术研究，都将具有重要的意义。然而，就目前的研究进展，人们对rbESCs的分离培养体系仍然需要深入研究。

目前，常用的分离ICM的方法有机械法、免疫外科法和显微分离法等。WANG等人利用孤雌激活的胚胎，培养出能长期传代的rbESCs，在分离ICM的时候发现免疫外科法分离效果不好。日本科学家Honda则利用显微操作仪技术，为ICM的分离提供了较好的方法。在不同物种的干细胞研究中，小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，mESCs)研究较多。mESCs只需要添加LIF即可长期稳定传代，保持具有边缘透亮，立体感的克隆。相比之下，rbESCs、人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells，hESCs)培养、建系较为困难。rbESCs、hESCs的培养基常添加bFGF，才有较大几率获得克隆，而培养出的rbESCs、hESCs表现出扁平克隆样，不能经受胰酶消化，需要小心传代。现在虽有多个实验室分离培养出了rbESCs并成功建系，但这也是在大量试验后得到的一小部分的成功，并且不同实验室操作手法、培养条件差异较大，获得出的rbESCs也存在差异。即使使用相同的培养基、相同的培养温度，但操作手法和胚胎个体差异也不能控制。大部分的rbESCs不能稳定传代，在培养过程中逐渐分化，只有极少数rbESCs能长期培养，有的实验室报道rbESCs能传几十代，而有的实验室报道的rbESCs只能传几代。