[发明专利]一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD基因的引物和实时荧光定量PCR方法

权利要求书

1.一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述PCR方法包括以下步骤：

1）中华乌塘鳢目的基因Mn-SOD的实时荧光定量引物设计：

利用如SEQ ID NO.1所示中华乌塘鳢Mn-SOD基因的开放阅读框序列，设计引物；

所述引物包括：

上游引物SEQ ID NO.3：5'- GGCACTGGCTAAAGGAGATG-3'；

下游引物SEQ ID NO.4：5'- TCCACTGGGAGAGAGATTCG-3'；

2）中华乌塘鳢内参基因GAPDH的实时荧光定量引物设计：

利用如SEQ ID NO.2所示中华乌塘鳢GAPDH基因的开放阅读框序列，设计引物；

所述引物包括：

上游引物SEQ ID NO.5：5'- TCCACCCACGGTCGCTAC-3' ；

下游引物SEQ ID NO.6：5'- TGTCCTCATTCACTCCCATC-3'；

3）中华乌塘鳢不同组织cDNA逆转录：

提取健康成年中华乌塘鳢不同组织的总RNA，并将提取的不同组织的总RNA分别逆转录成cDNA，0℃以下保存备用；

4）中华乌塘鳢Mn-SOD基因的实时荧光定量PCR检测：

以逆转录的cDNA为模板，以GAPDH为内参基因，在ABI 7500 Fast Real-time PCRsystem上对中华乌塘鳢Mn-SOD基因的表达水平进行检测，分析Mn-SOD基因在中华乌塘鳢不同组织中的表达与分布情况。

2.根据权利要求1所述一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述步骤1）中，利用SEQ ID NO.1所示中华乌塘鳢Mn-SOD基因开放阅读框序列，通过Primer Premier5软件，设计出产物片段大小在150~300bp，退火温度60℃的引物序列。

3.根据权利要求1所述一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述步骤2）中利用如SEQ ID NO.2所示的中华乌塘鳢GAPDH基因开放阅读框序列，通过Primer Premier5软件，设计出产物片段大小在150~300bp，退火温度60℃的引物序列。

4.根据权利要求1所述一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述步骤3）中，采集健康成年中华乌塘鳢个体，处死后快速采集心脏、肝脏、脾脏、头肾、肌肉、皮肤、血液、鳃、小肠与脑，迅速投入到液氮中进行保存；利用Trizol Reagent试剂对中华乌塘鳢不同组织的总RNA分别进行提取，取4~6 μg总RNA，利用SuperScript IIIReverse Transcriptase kit 试剂盒逆转录成cDNA，-20℃保存备用。

5.根据权利要求1所述一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述步骤4）中，利用SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒，中华乌塘鳢不同组织逆转录cDNA为模板，开展中华乌塘鳢Mn-SOD基因的实时荧光定量PCR检测，以中华乌塘鳢GAPDH为内参基因，利用2^-ΔΔCt方法分析检出Mn-SOD基因在中华乌塘鳢不同组织中的表达与分布情况。