[发明专利]一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD基因的引物和实时荧光定量PCR方法

说明书

本发明涉及荧光定量PCR检测方法技术领域，特别涉及一种用于检测中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)Mn‑SOD基因的引物及实时荧光定量PCR法，该方法利用实时荧光定量PCR技术分析中华乌塘鳢不同组织的Mn‑SOD基因表达量，以GAPDH为内参基因，设计内参基因引物和目的基因引物；以逆转录的cDNA为模板，在ABI 7500 Fast Real‑time PCR system上对目的基因的表达水平进行检测，对检测结果进行统计分析，能快速、准确的检出Mn‑SOD基因在中华乌塘鳢不同组织中的表达与分布情况，为该基因的利用和研究提供科学依据。

技术领域

本发明涉及荧光定量PCR检测方法技术领域，特别涉及一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD基因的引物及实时荧光定量PCR法。

背景技术

中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)，隶属于鲈形目塘鳢科乌塘鳢属，系河口咸淡水暖水性小型鱼类。该鱼肉质细腻，营养价值高，具有加速伤口愈合的功效，是名贵的食用鱼之一。目前，中华乌塘鳢已成为我国福建、广东、广西等地区重要的海水经济养殖鱼类之一。随着环境污染和养殖水体的不断恶化，中华乌塘鳢不断受到病菌、重金属、有机污染物等的胁迫，导致出现由氧自由基造成的机体氧化损伤及多种疾病的发生，严重影响中华乌塘鳢养殖业的发展。Mn-SOD是生物体内重要的一类超氧化物歧化酶，广泛分布于动物、植物和微生物中，在清除氧自由基以及抗逆方面发挥非常重要的作用。

因此，检测Mn-SOD基因在中华乌塘鳢体内的表达量，对于研究中华乌塘鳢抗逆境胁迫相关机制的研究具有重要的意义。

然而，目前有关中华乌塘鳢Mn-SOD基因实时荧光定量PCR检测方法尚未见系统报道。

本发明针对现有技术的不足，探索开发一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD基因的引物及实时荧光定量PCR法。

发明内容

为解决目前尚无对中华乌塘鳢Mn-SOD基因进行实时荧光定量PCR检测方法的问题，本发明提供了一种中华乌塘鳢Mn-SOD基因的实时荧光定量PCR检测方法及所用引物。本发明首要要实现对中华乌塘鳢Mn-SOD基因进行实时荧光定量PCR检测的目的。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD的实时荧光定量PCR方法，所述PCR方法包括以下步骤：

1)中华乌塘鳢目的基因Mn-SOD的实时荧光定量引物设计：

利用如SEQ ID NO.1所示中华乌塘鳢Mn-SOD基因的开放阅读框序列，设计引物；

2)中华乌塘鳢内参基因GAPDH的实时荧光定量引物设计：

利用如SEQ ID NO.2所示中华乌塘鳢GAPDH基因的开放阅读框序列，设计引物；

3)中华乌塘鳢不同组织cDNA逆转录：

提取健康成年中华乌塘鳢不同组织的总RNA，并将提取的不同组织的总RNA分别逆转录成cDNA，0℃以下保存备用；

4)中华乌塘鳢Mn-SOD基因的实时荧光定量PCR检测：

以逆转录的cDNA为模板，以GAPDH为内参基因，在ABI 7500Fast Real-time PCRsystem上对中华乌塘鳢Mn-SOD基因的表达水平进行检测，分析Mn-SOD基因在中华乌塘鳢不同组织中的表达与分布情况。

作为优选，所述步骤1)中，利用SEQ ID NO.1所示中华乌塘鳢Mn-SOD基因开放阅读框序列，通过Primer Premier5软件，设计出产物片段大小在150～300bp，退火温度60℃的引物序列。