[发明专利]一种PLG和CRD功能片段重组融合蛋白及其制备方法和抗癌药物

说明书

本发明公开了一种PLG和CRD功能片段重组融合蛋白及其制备方法和抗癌药物。本发明提供的融合蛋白包括：能够抑制肿瘤血管生成的人血纤维蛋白溶酶原的功能片段，识别肿瘤细胞表面糖基配体的半乳糖凝集素蛋白的糖基识别结合结构域，和刚性或柔性连接肽。本发明所述融合蛋白一方面增强了其抑制肿瘤血管生成的能力；另一方面能增强了对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，具有更好的抗肿瘤活性。本发明还提供了所述融合蛋白的制备方法和应用药物。

技术领域

本发明属于重组融合蛋白领域，特别涉及一种PLG和CRD功能片段重组融合蛋白及其制备方法和抗癌药物。

技术背景

肿瘤血管生成是肿瘤生长、转移和复发的先决条件。当肿瘤体积超过2-3mm³时局部缺血缺氧，刺激肿瘤新生血管的形成。新生血管不仅可以给肿瘤细胞提供营养，降解对肿瘤细胞生长不利的代谢产物，也为肿瘤细胞的血行转移提供了条件。因此，靶向肿瘤血管的生成是目前癌症治疗的重要策略。目前已临床应用的抗肿瘤血管生成药物主要有单抗类、竞争性受体类、小分子激酶抑制剂、天然产物及其衍生物等。

人血纤维蛋白溶酶原(plasminogen，简称PLG)是人血纤维蛋白溶酶的前体，其N端包括5个通过二硫键连接的联环区结构(kringle)，第一到第四个kringle可以在内源性基质酶的作用下降解为血管抑素(angiostatin)。有研究发现，重组PLG的第五个kringle(PK5)结构域能够抑制血管内皮细胞的增殖，迁移，诱导内皮细胞凋亡，具有更强的抗血管生成活性，是目前分子量最小，活性最稳定的内源性血管增生抑制因子。但是PK5对肿瘤细胞的直接杀伤能力有限。

半乳糖凝集素-3属于特异性识别β-半乳糖残基的半乳糖凝集素家族，也是唯一的嵌合型半乳糖凝集素，主要由N-端一段与胶原蛋白序列同源的肽链和C-端的一个糖基识别结合结构域(Carbohydrate-recognition domain,简称CRD)组成。半乳糖凝集素-3广泛分布在细胞外、细胞膜、细胞质及细胞核中。半乳糖凝集素-3与糖基配体结合后通过N端的肽链的相互作用形成五聚体，进而介导细胞与细胞，细胞与基质之间的相互作用和信号传递，对肿瘤细胞的抗凋亡、免疫逃逸和血管生成起促进作用。此外，有研究报道，半乳糖凝集素-3用胶原酶水解分离得到CRD片段能够抑制乳腺癌原位肿瘤的生长和转移，与化疗药物联合使用能抑制多发性骨髓瘤的生长。单独CRD片段的抗肿瘤机理可能是竞争性抑制内源性半乳糖凝集素-3的功能。

蛋白多肽类药物是目前抗肿瘤药物研发的热点之一，与以往小分子药物相比，蛋白多肽类药物具有活性高、特异性强、毒性低，生物相容性好，有利于临床应用的特点。融合蛋白是将具有不同功能的蛋白片段通过连接肽融合表达，提高重组蛋白的靶向性和生物活性，也是目前重组蛋白质类药物的研发途径之一。

发明内容

本发明将具有抗血管生成作用的PK5和具有识别并结合细胞表面糖基配体功能的CRD通过刚性连接肽(Rigid linker，简称RL)或柔性连接肽(Flexible linker，简称FL)连接组成重组融合蛋白PK5-RL/FL-CRD，一方面增强对血管内皮细胞的杀伤能力，抑制肿瘤血管生成；另一方面能够增强融合蛋白对肿瘤细胞的识别和靶向性，提高对肿瘤细胞的杀伤能力；融合蛋白的双靶向性具有更好的抗肿瘤效果。此外，还提供了重组融合蛋白原核表达载体的制备和蛋白纯化，融合蛋白的体外抗血管生成和抑制肿瘤增殖功能，以及药物组合和体内抗肿瘤功能。

本发明技术方案如下：

一种PLG和CRD功能片段重组融合蛋白，其特征在于，人血纤维蛋白溶酶原第五个kringle结构域功能片段通过连接肽与半乳糖凝集素-3的糖基结合结构域功能片段结合。

进一步的，所述人血纤维蛋白溶酶原第五个kringle结构域功能片段起始于人血纤维蛋白溶酶原第481位氨基酸，含端点，终于人血纤维蛋白溶酶原第560位氨基酸，具体氨基酸序列为：SEQ.NO.1。