[发明专利]一种基于拉曼-荧光双模式探针的活细胞内细胞色素c的检测方法

权利要求书

1.一种基于拉曼-荧光双模式探针的活细胞内细胞色素c的检测方法，其特征在于，所述检测方法是基于表面增强拉曼散射和荧光共振能量转移的“开-关”转换，通过在AuNTs上组装Cyt c的适配体及其部分互补的修饰荧光团Cy5的DNA构建的纳米传感器实现双重信号的检测；所述拉曼-荧光双模式探针是由AuNTs修饰Cyt c的适配体、与其适配体部分互补配对的修饰Cy5的互补链制得；所述拉曼-荧光双模式探针的制备方法包括如下步骤：

（1）制备金种子：将50 μL 25 mM的HAuCl₄溶液加入到4.7 mL的0.1M CTAC溶液中，在剧烈搅拌下注入300 μL新鲜制备的预冷的10 mM NaBH₄溶液，溶液由淡黄色变成橘色后在室温下静置2 h以消耗过量的NaBH₄，备用；

（2）制备AuNTs：将制备的种子用0.1 M CTAC溶液稀释10倍后，接着制备两种生长液：

（2a）将1.6 mL 0.1 M CTAC溶液加入8 mL超纯水中，再加入40 μL 50 mM HAuCl₄和15 μL 10 mM NaI，制得生长液A；

（2b）将500 μL 50 mM HAuCl₄加入到40 mL 0.05 M CTAC中，然后加入300 μL 10 mMNaI，制得生长液B；

（2c）将40 μL与400 μL的0.1 M 抗坏血酸溶液分别加入到生长液A与B中，并且搅拌至两种溶液由浅黄色至完全透明，然后将100 μL稀释的种子加入到生长液A中，搅拌不超过5s后，立即将3.2 mL该溶液加入到生长液B中并搅拌5 s，最后将生长液B在室温下静置1 h，1h后继续向生长液B中添加5 mL 25% CTAC溶液，过夜后吸除上清，将沉淀重悬在5 mL超纯水中；

（3）制备拉曼-荧光双模式探针：

（3a）在重悬的AuNTs中加入SH-PEG-COOH 溶液并且不断搅拌1 h，以3000 rpm的转速离心10 min，将DNA溶液置于高于Tm温度的水浴中5 min；

（3b）然后将Cyt c适配体DNA1溶液加入到AuNTs中，使DNA1终浓度为1 μM，混合液置于摇床中，37℃、120 rpm的条件下孵育过夜后，3000 rpm 15 min离心除去过量反应物，重悬到原体积；

（3c）再加入Cyt c适配体互补链DNA2，使DNA2终浓度为500 nM，混合均匀后置于摇床，于37℃、120 rpm的条件下并孵育过夜；

（3d）离心除去未反应的DNA，重悬后，再加入20 μL细胞膜穿透肽，37℃振荡过夜孵育，最后以3000 rpm的转速离心两次，每次10 min，重悬，备用；

所述的Cyt c的适配体DNA1序列为：5’-SH-AGTGTGAAATATCTAAACTAAATGTGGAGGGTGGGACGGGAAGAAGTTTATTTTTCACACT-3’；

互补链DNA2序列为：5’-ATATTTCACACT-Cy5-3’；

所述检测方法中拉曼检测包括如下步骤：待细胞生长到对数生长期后，将细胞按80000个/mL的密度接种350 μL到无菌石英片上，细胞培养至贴壁后，吸出旧培养基，加入混匀探针的基本培养基2 mL，与细胞共培养24 h，吸出含有探针的培养基并用PBS清洗三次，然后加入混有相同浓度的AFB1的基本培养基，分别共培养0、0.25、0.5、0.75、1、1.5和2 h，马上进行SERS光谱检测和SERS成像；

所述检测方法中荧光检测包括如下步骤：待细胞生长到对数生长期后，将细胞按40000个/mL的密度接种500 μL到激光共聚焦专用小皿上，细胞培养至贴壁后，吸出旧培养基，加入混匀组装体的基本培养基500 μL，与细胞共培养24 h，吸出含有探针的培养基并用PBS清洗三次，然后加入混有相同浓度的AFB1的基本培养基，分别共培养0、0.25、0.5、0.75、1、1.5和2 h；然后吸出含有AFB1的培养基，用PBS清洗三次，并用DAPI染色3 min，3 min后清洗DAPI，并马上进行荧光成像。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的活细胞是人的肝癌细胞HepG2。