[发明专利]一种基于拉曼-荧光双模式探针的活细胞内细胞色素c的检测方法

说明书

本发明公开了一种基于拉曼‑荧光双模式探针的活细胞内细胞色素c的检测方法，所述检测方法是基于表面增强拉曼散射和荧光共振能量转移的“开‑关”转换，通过在金三角片(AuNTs)上组装细胞色素c(Cyt c)的适配体及其部分互补的修饰荧光团Cy5的DNA构建的纳米传感器实现双重信号的检测。本发明方法能够同时检测用拉曼和荧光两种信号同时检测活细胞内Cyt c，且检测特异性强、灵敏度高、准确度高，与ELISA相比误差小于5％。

技术领域

本发明涉及纳米材料和生命科学领域，尤其是涉及一种基于拉曼-荧光双模式探针的活细胞内细胞色素c(Cyt c)的定量检测方法。

背景技术

细胞凋亡是程序性细胞死亡的过程，是一种复杂且高度调节的过程，对细胞生长和增殖具有显着影响。作为早期凋亡的重要生物标志物，细胞色素c(Cyt c) 被认为是内在凋亡途径的关键组分，并且通常表明细胞凋亡中的无回归点。在正常条件下，Cyt c存在于细胞中线粒体膜的顶部，充当Cyt c还原酶和Cyt c氧化酶之间的线粒体膜空间中的电子载体。当细胞处于病理条件下时，线粒体膜孔开放，Cyt c从线粒体释放到细胞质中，激活caspase凋亡蛋白家族，扩增死亡受体途径，导致细胞凋亡或坏死。因此，细胞质中Cyt c含量的增加可被视为早期细胞凋亡的信号。许多物质都会引起细胞凋亡，包括食物中的许多毒素。研究毒素对细胞的影响主要涉及细胞毒理学。在毒理学实验中，大多数细胞状态的研究需要荧光染色，从而抑制了细胞的实时观察。此外，它无法精细地观察细胞内物质的变化。因此，开发一种不需要染色并且可以实时监测细胞内物质和细胞状态变化的毒理学方法具有重要的研究意义。

目前已经开发了多种用于Cyt c检测的方法，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析、高效液相色谱(HPLC)、分光光度法和流式细胞术。虽然已有的方法具有高灵敏度，但大多数这些方法不适用于检测活细胞中的Cyt c，因为它们通常需要裂解或固定细胞样品。因此，出现了Cyt c的无损检测方法，但这些方法中的大多数都集中在活细胞中Cytc的定性荧光成像上。活细胞中Cyt c 的定量分析仍然是一个挑战。更准确的定量和原位实时追踪活细胞中Cyt c可以提供评估与死亡，疾病进展，治疗和线粒体损伤相关的过程所需的更好的实时信息。

拉曼光谱是可以标记特定的化学基团的指纹光谱，因此它已经成为一种常用的化学成分分析手段。利用拉曼光谱分析样品不需要特殊的制备步骤，并具备无损测量的优势。相比传统的红外光谱检测手段易受到水溶液的背景干扰，而水的拉曼光谱很弱，因此，对于生物样品来说，拉曼光谱是一种很理想的分析手段。然而，多数样品，特别是生物样品，由于其较弱的拉曼散射强度，在一定程度上阻碍了这一技术在多个领域的应用。由此，表面增强拉曼光谱(surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)技术应运而生。其原理是基于被测分子吸附在某些经特殊处理、具有纳米结构的金属表面具有极强拉曼散射增强效应的分子振动光谱技术。因SERS技术具有前处理简单、操作简便、检测时间短、灵敏度高等优点，在生命科学、食品安全检测等领域具有良好的应用前景。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种基于拉曼-荧光双模式探针的活细胞内Cyt c的检测方法。本发明方法能够同时检测用拉曼和荧光两种信号同时检测活细胞内Cyt c，且检测特异性强、灵敏度高、准确度高，与ELISA 相比误差小于5％。

本发明的技术方案如下：

一种基于拉曼-荧光双模式探针的活细胞内细胞色素c的检测方法，所述检测方法是基于表面增强拉曼散射(SERS)和荧光共振能量转移(FRET)的“开-关”转换，通过在金三角片(AuNTs)上组装Cyt c的适配体及其部分互补的修饰荧光团 Cy5的DNA构建的纳米传感器实现双重信号的检测。

所述拉曼-荧光双模式探针是由AuNTs修饰Cyt c的适配体、与其适配体部分互补配对的修饰Cy5的互补链制得。

所述拉曼-荧光双模式探针的制备方法包括如下步骤：