[发明专利]一种大肠杆菌肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白及其编码基因和应用

权利要求书

1.一种肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种编码肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ IDNo.1所示。

3.一种重组载体，其特征在于，所述载体含有SEQ ID No.1所示基因，为重组克隆载体或重组表达载体。

4.根据权利要求3所述重组载体，其特征在于，所述重组表达载体为真核表达载体。

5.一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌含有SEQ ID No.1所示基因或重组载体；其中，所述重组载体含有SEQ ID No.1所示基因，为重组克隆载体或重组表达载体。

6.根据权利要求5所述宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为毕赤酵母。

7.如权利要求1所述肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白在制备预防或治疗大肠埃希氏菌腹泻疾病蛋白疫苗中的应用。

8.一种包含权利要求1所述肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的疫苗。

9.一种如权利要求1所述肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、STa-LTB-STb融合基因构建，包括步骤：

S11、肠毒素基因LTB PCR扩增：

以ETEC F4ac菌体裂解液为模板，SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物对LTB基因进行PCR扩增；

S12、肠毒素基因STb PCR扩增：

以ETEC F4ac菌体裂解液为模板，SEQ ID No.5、SEQ ID No.6为引物对STb基因进行PCR扩增；

S13、肠毒素基因STa PCR扩增：

利用重叠延伸PCR，以SEQ ID No.7、SEQ ID No.8为引物对STa基因进行扩增；

S14、LTB-STb二价融合基因构建：

以步骤S11所得LTB基因和步骤S12所得STb基因为模板，SEQ ID No.3和SEQ ID No.6为引物，利用重叠延伸PCR对LTB-STb基因进行扩增；

S15、STa-LTB-STb三价融合基因构建：

以步骤S13所得STa基因和步骤S14所得LTB-STb基因为模板，SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10为引物，利用重叠延伸PCR对STa-LTB-STb基因进行扩增；

S2、STa-LTB-STb融合蛋白真核表达，包括步骤：

S21、构建肠毒素STa-LTB-STb融合基因真核表达载体：

将STa-LTB-STb融合基因连接克隆载体，将重组载体导入感受态细胞中；提取重组质粒，之后分别对重组质粒和毕赤酵母表达载体进行酶切，获得STa-LTB-STb融合基因目的片段和毕赤酵母载体片段；利用连接酶连接酶切后的STa-LTB-STb融合基因目的片段和毕赤酵母载体片段，得真核表达载体；将所得真核表达载体导入感受态中；

S22、重组毕赤酵母表达菌株的构建：

对步骤S21所得真核质粒表达载体进行单酶切，将真核质粒表达载体线性化并切胶回收处理；利用电转化法将回收纯化的线性化真核质粒表达载体电转入毕赤酵母感受态细胞，并用含有博来霉素抗性培养基筛选阳性菌株，传代培养两代，直至菌株生长稳定；

S23、重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的诱导表达：

对毕赤酵母重组菌株进行液体培养，选用YPD液体培养基，每24h向培养基中加入其体积1％的甲醇，诱导96h，对上清液进行浓缩，获得肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白溶液。

10.一种如权利要求8所述肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、STa-LTB-STb融合基因构建，包括步骤：

S11、肠毒素基因LTB PCR扩增：

以ETEC F4ac菌体裂解液为模板，SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物对LTB基因进行PCR扩增；

S12、肠毒素基因STb PCR扩增：

以ETEC F4ac菌体裂解液为模板，SEQ ID No.5、SEQ ID No.6为引物对STb基因进行PCR扩增；

S13、肠毒素基因STa PCR扩增：

利用重叠延伸PCR，以SEQ ID No.7、SEQ ID No.8为引物对STa基因进行扩增；

S14、LTB-STb二价融合基因构建：

以步骤S11所得LTB基因和步骤S12所得STb基因为模板，SEQ ID No.3和SEQ ID No.6为引物，利用重叠延伸PCR对LTB-STb基因进行扩增；

S15、STa-LTB-STb三价融合基因构建：

以步骤S13所得STa基因和步骤S14所得LTB-STb基因为模板，SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10为引物，利用重叠延伸PCR对STa-LTB-STb基因进行扩增；

S2、STa-LTB-STb融合蛋白真核表达，包括步骤：

S21、构建肠毒素STa-LTB-STb融合基因真核表达载体：

将STa-LTB-STb融合基因连接克隆载体，将重组载体导入感受态细胞中；提取重组质粒，之后分别对重组质粒和毕赤酵母表达载体进行酶切，获得STa-LTB-STb融合基因目的片段和毕赤酵母载体片段；利用连接酶连接酶切后的STa-LTB-STb融合基因目的片段和毕赤酵母载体片段，得真核表达载体；将所得真核表达载体导入感受态中；

S22、重组毕赤酵母表达菌株的构建：

对步骤S21所得真核质粒表达载体进行单酶切，将真核质粒表达载体线性化并切胶回收处理；利用电转化法将回收纯化的线性化真核质粒表达载体电转入毕赤酵母感受态细胞，并用含有博来霉素抗性培养基筛选阳性菌株，传代培养两代，直至菌株生长稳定；

S23、重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的诱导表达：

对毕赤酵母重组菌株进行液体培养，选用YPD液体培养基，每24h向培养基中加入其体积1％的甲醇，诱导96h，对上清液进行浓缩；培养液进行离心，离心条件为2000rpm，5min；将获得的上清液加入超滤管，4000rpm离心25min，将收集液保存备用，即为肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白溶液；

S3、重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白疫苗的制备：

以步骤S2获得的重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白作为抗原，结合佐剂，制备成疫苗，其中所述佐剂为弗氏完全佐剂或铝佐剂。