[发明专利]一种大肠杆菌肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白及其编码基因和应用

说明书

本发明公开了一种大肠杆菌肠毒素STa‑LTB‑STb融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，基因序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了所述肠毒素STa‑LTB‑STb融合蛋白在制备预防或治疗大肠埃希氏菌腹泻疾病蛋白疫苗中的应用，所述肠毒素STa‑LTB‑STb融合蛋白同时具有热稳定肠毒素和热敏肠毒素免疫原性；将肠毒素STa‑LTB‑STb融合蛋白制备成疫苗，作为抗原对哺乳动物进行免疫，可以诱导机体产生高水平的热稳定肠毒素抗体和热敏肠毒素抗体，提高疫苗的保护效果，有效预防肠毒性大肠埃希杆菌对畜牧业生产的危害。

技术领域

本发明涉及本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

大肠杆菌原名大肠埃希菌，是最常见的肠道致病菌之一，常存在于温血动物的肠道中。大部分的大肠杆菌是无害的，但一些菌株会导致宿主出现严重的食物中毒症状，包括腹泻疾病。本发明选择一种致病性大肠杆菌——产肠毒素大肠杆菌(ETEC)作为主要研究对象，主要原因在于ETEC是造成发展中国家人民发生细菌性腹泻的主要致病菌之一，也是引起婴幼儿、旅游者以及幼龄动物腹泻的主要病原菌，会导致仔猪和犊牛大规模的发病以及死亡。由此，研制一种高效且适用范围广泛的ETEC疫苗已迫在眉睫。

ETEC主要有两种致病因子——黏附素和肠毒素。主要致病机理如下：首先是黏附素的定植过程，ETEC进入到肠道中后，其表面的黏附素会与肠道细胞上的受体进行特异性结合，以抵抗由于肠道蠕动产生的冲刷作用，使细菌定植下来，并产生一种或两种肠毒素。下一个阶段是肠毒素的致病过程，两类肠毒素，热稳定肠毒素(ST)和热敏肠毒素(LT)分别与各自的受体结合，启动一系列级联反应，最后导致腹泻。

目前市场上已有一些针对ETEC的疫苗，主要包括全菌灭活疫苗和LT肠毒素亚单位疫苗，以下列举一些目前在市场上销售的ETEC兽用疫苗，这些也是畜牧业生产中使用的兽用疫苗的典型代表：

通用名：仔猪大肠埃希氏菌病三价灭活疫苗；商品名：肠可净，上海海利生物技术股份有限公司，兽药生字(2010)090201028。

通用名：仔猪大肠杆菌三价灭活疫苗；商品名：卸力佳，成都天邦生物制品有限公司，兽药生字(2010)220011028。

通用名：仔猪大肠埃希氏菌病三价灭活疫苗；商品名：立净诺，浙江诗华诺倍威生物技术有限公司，兽药生字110571028。

目前市场上销售的这些针对ETEC研制的兽用疫苗都有一些缺陷，例如：全菌疫苗对细菌进行直接灭活处理，但并未清除内毒素，导致使用存在安全风险；菌毛蛋白疫苗仅仅针对少数几种ETEC菌株发挥作用，保护范围较窄，且不能对抗肠毒素抗原；同时，市场上目前并没有ST肠毒素疫苗。针对这些问题，解决方法就是建立一种既含有LT肠毒素又含有ST肠毒素抗原蛋白的新型疫苗，使其对ETEC感染过程中主要致病因子——肠毒素起到免疫作用。

ETEC产生两种肠毒素，根据热稳定性差异可分为耐热肠毒素ST和不耐热肠毒素LT。ST肠毒素可在100℃，30min条件下保持活性，跟据生物学特性及致病性可分为STa和STb两个亚型。STa和STb的分子量都很小，免疫原性较弱，只有融合到大分子蛋白上或者与载体蛋白偶联时才能表现出较好的免疫原性。LT肠毒素是一种分子量约为86kDa的寡聚体蛋白质，由一个A亚基(LTA)和5个B亚基(LTB)组成，对温度敏感。研究表明，完整LT和LTB均具备免疫佐剂的作用，可以刺激动物产生体液和细胞免疫应答，产生特异性抗体sIg A和IgG。LT在防止产生免疫耐受、优化免疫途径和加强免疫等方面有重要作用。根据ST和LT肠毒素各自的特点，可以利用分子生物学原理和基因工程手段，以LT或LTB亚基为载体蛋白，将小分子STa和STb偶联到载体蛋白上，构建融合蛋白，使STa和STb呈现免疫原性，激发机体产生抗STa和STb保护性免疫作用。以下是研究人员在肠毒素融合蛋白方面的探索：