[发明专利]一种提高CAR-T细胞转染效率的方法在审
| 申请号： | 201811363377.8 | 申请日： | 2018-11-16 |
| 公开（公告）号： | CN109439632A | 公开（公告）日： | 2019-03-08 |
| 发明（设计）人： | 胡宗涛;吕东来;王宏志 | 申请（专利权）人： | 中国科学院合肥肿瘤医院 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/867 |
| 代理公司： | 重庆市信立达专利代理事务所(普通合伙) 50230 | 代理人： | 包晓静 |
| 地址： | 230031 *** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 质粒 感染 慢病毒感染 脂质体转染 电转 构建 激活 正常培养基 细胞转染 质粒构建 肿瘤治疗 转染效率 慢病毒 脂质体 包被 换液 混匀 孔板 稀释 病毒 血液 保证 | ||
1.一种提高CAR-T细胞转染效率的方法，其特征在于，所述的提高CAR-T细胞转染效率的方法，具体包括以下步骤：
步骤一：构建CAR质粒，保证质粒浓度在1500ng/ul以上；
步骤二：CAR质粒构建完成后，进行CAR脂质体构建；
步骤三：利用CAR质粒对慢病毒进行包装，48小时后收病毒；
步骤四：利用PBS对血液进行稀释，成分混匀，对PBMC细胞进行提取；
步骤五：在T细胞激活过程中进行感染，提取后PBMC加入CD3抗体包被的24孔板中过夜进行T细胞激活，而后进行电转、脂质体转染和慢病毒感染，6h后换液为正常培养基。
2.如权利要求1所述的提高CAR-T细胞转染效率的方法，其特征在于，所述步骤二中，CAR脂质体构建，具体为：
EP管1内：加入CAR质粒和100ulOpti-MEM中，加入5ulP3000充分混匀；
EP管2内：100ulOpti-MEM+5ul Lipo3000，管1和2混匀后室温下静置15min。
3.如权利要求1所述的提高CAR-T细胞转染效率的方法，其特征在于，所述步骤三中，利用CAR质粒包装慢病毒，具体为：
(1)EP管1内：5ug CAR质粒+3.75ugPSPAX2+1.25ugPMD2.G加入250ulOpti-MEM中，加入12ulP3000充分混匀，EP管2内：250ulOpti-MEM+12ul Lipo3000，管1和2混匀后室温下，静置15min；
(2)更换293T培养基为无血清无双抗Opti-MEM或无血清无双抗DMEM培养基5ml；
(3)15min后将混合液逐滴加入到293T中；6h后更换为7mlDMEM培养基；
(4)48后收病毒。
4.如权利要求1所述的提高CAR-T细胞转染效率的方法，其特征在于，所述步骤四中，提取PBMC细胞，具体包括以下步骤：
(1)PBS将血液稀释一倍，充分混匀；
(2)15mL离心管内加入5ml Ficoll，加入10ml血液，按照血液:Ficoll＝2:1的比例，将血细胞缓慢加至Ficoll上层；
(3)500g离心20min，20摄氏度，ACC 1，DCC 0，吸取白膜层细胞(PBMC)
(4)加入PBS，定容至50mL；
(5)1700rpm离心5min，小心吸走上清，PBS继续洗涤一次，PBMC细胞计数，进行下一步刺激；
(6)提取PBMC细胞分为ABC三组，同时使用CD3抗体20ug/ml包被24孔板。
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