[发明专利]一种提高CAR-T细胞转染效率的方法

说明书

本发明属于肿瘤治疗技术领域，公开了一种提高CAR‑T细胞转染效率的方法。构建CAR质粒，保证质粒浓度在1500ng/ul以上；CAR质粒构建完成后，进行CAR脂质体构建；利用CAR质粒对慢病毒进行包装，48小时后收病毒；利用PBS对血液进行稀释，成分混匀，对PBMC细胞进行提取；在T细胞激活过程中进行感染，提取后PBMC加入CD3抗体包被的24孔板中过夜进行T细胞激活，而后进行电转、脂质体转染和慢病毒感染，6h后换液为正常培养基。本发明相比于电转、脂质体转染，慢病毒感染对T细胞而言有更高的效率；在T细胞激活过程中进行感染比激活前/激活后进行感染，CAR阳性感染的T细胞增多。

技术领域

本发明属于肿瘤治疗技术领域，尤其涉及一种提高CAR-T细胞转染效率的方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

嵌合抗原受体修饰T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)是目前肿瘤治疗研究的热门领域，它是过继免疫治疗的典型代表。通过利用基因转导技术，使T细胞表面可以稳定表达具有特异性识别肿瘤相关抗原能力的单链可变区片段(single-chain variable fragment，scFv)，并与CD3ζ及其他T细胞共刺激分子如CD28/CD137之间相连接，通过非MHC限制性识别的方式，利用抗原抗体亲和力高、特异性强的特点，特异、高效地激活T细胞，进而对表达该肿瘤相关抗原的肿瘤细胞产生杀伤效应，是目前较为成熟的、靶向性强、特异性高、杀瘤范围广、效果持久的治疗方式。在治疗急/慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤等非实体瘤中展现出了极强的效果，大大提升了患者的生存期，减缓了复发，增加了患者缓解率90％，使用后患者的完全缓解生存时间可达2年。CAR在实体瘤的治疗中尚处于初期阶段，相应取得一定的效果。然而然而体外长时程培养会导致T细胞活性降低，转染(感染)过程中由于培养基营养缺乏也会很大程度降低T细胞的活化。另外由于嵌合抗原受体(CAR)的基因序列较大，一般超过10000bp左右，转染(感染)难度大，效率低下，对于转染困难的T细胞而言更加不易转入。

综上所述，现有技术存在的问题是：

现有技术中由于嵌合抗原受体(CAR)的基因序列较大，一般超过10000bp左右，转染(感染)难度大，效率低下，对于转染困难的T细胞而言更加不易转入。

解决上述技术问题的难度和意义：

临床方面：在CAR-T细胞治疗中，仅仅有CAR阳性的T细胞能够发挥功能。由于制备CAR-T细胞的T细胞主要来源于人外周血，受限于获取途径和收集数量，所能得到用于感染的T细胞数目极少，在这种限制条件下，找寻提高感染CAR阳性T细胞数目的方法，对于临床治疗有重要意义。

技术方面：目前T细胞主要通过电转、脂质体转染和慢病毒感染等方法进行转染，而转染(感染)的效率又很大程度上取决于质粒大小和细胞状态。CAR质粒大小通常较大一般在8000～10000bp，因此前期实验显示常用的电转和脂质体细胞转染条件并不能够有效的将如此大的质粒转入T细胞中，即使进行慢病毒转染T细胞也不能达到理想的感染效率。因此我们需要发现更有效的方法，在减小转染(感染)对细胞状态影响的同时，又保证转染(感染)后细胞的阳性率。进而在一定数量外周血中能够制备出足够的CAR阳性T细胞用于临床治疗。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高CAR-T细胞转染效率的方法。

本发明是这样实现的，一种提高CAR-T细胞转染效率的方法，具体包括以下步骤：

步骤一：构建CAR质粒，保证质粒浓度在1500ng/ul以上；

步骤二：CAR质粒构建完成后，进行CAR脂质体构建；

步骤三：利用CAR质粒对慢病毒进行包装，48后收病毒；