[发明专利]一种细胞内支架，由其构造的质粒及质粒的应用

说明书

本发明公开了一种细胞内支架，由其构造的质粒及质粒的应用，细胞内支架包括DNA支架序列和TALE‑目的分子融合蛋白；DNA支架序列包括结合序列BM1、结合序列BM2和结合序列BM3，TALE‑目的分子融合蛋白包括TALE1‑目的分子融合蛋白、TALE2‑目的分子融合蛋白和TALE3‑目的分子融合蛋白；TALE1‑目的分子融合蛋白结合在结合序列BM1上，TALE2‑目的分子融合蛋白结合在结合序列BM2上，TALE3‑目的分子融合蛋白结合在结合序列BM3上。将DNA支架序列构建在pSB1C3、BBa_J63009或pSB4A5质粒上；将TALE‑目的分子融合蛋白构建至pET28a(+)质粒上，将获得的改造质粒共转化至大肠杆菌中，进行IPTG诱导表达，可应用于甲羟戊酸合成反应中提高甲羟戊酸的产量。

技术领域

本发明涉及生物工程和生物制造领域，特别涉及利用分子生物学技术和基因编辑技术发明一种新型的细胞内支架结构，由其构造的质粒及质粒的应用。

背景技术

萜类化合物是一类高度多样性的天然产物，通常从植物、微生物和海洋生物中分离而来，可以被用作芳香剂、香精油、保健营养品、药品等。比如，从植物中萃取的萜烯化合物紫杉醇和青蒿素分别被用作抗癌和抗疟疾的药物。但是自然生产这些化合物的产量都很小，从生物产物中纯化只能得到很少的目标产物。同时由于它们与大量其他的自然产物混合在一起，其纯度很低，并且容易被其他物质消耗掉。萜烯化合物的化学合成一直以来都很困难，不止价格昂贵，产量也相对较低，更大的困难是因为这些化学分子结构复杂难以通过化学手段合成生产。因此改造微生物代谢通路大量生产复杂的萜烯化合物，成为了一个非常有吸引力的替代方案。甲羟戊酸途径的产物是所有类异戊二烯生物合成的通用前体，而甲羟戊酸(Mevalonate，MEV)作为萜类代谢途径中的关键前体，其产量的提高对于大力生产萜类化合物至关重要。因此，如何合理的引入外源甲羟戊酸合成途径，精准调节代谢通路的酶表达，有利于在工业和商业生产上大规模应用微生物细胞工厂。

甲羟戊酸途径被认为由七个酶组成：乙酰辅酶A乙酰基转移酶(AtoB)，羟甲基戊二酸单酰辅酶A合酶(HMGS)，羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)，甲羟戊酸激酶(MK)，磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)，甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(PMD)，以及异戊烯二磷酸异构酶(IDI)。HMGR是甲羟戊酸途径的限速酶，而该酶为整个途径的限速酶，其产物甲羟戊酸的产生量直接决定了最终萜类化合物的合成效率。因此，如何提高提高甲羟戊酸的合成成为微生物萜类代谢的重要课题。

细胞内组织排布是细胞代谢的一个关键因素，生物学的复杂性需要不同程度层次的组织排布。细胞利用区域共聚化以进行多种维持生命所必需的酶促反应和进程，建立底物的局部浓度梯度，增加酶反应速率，支持代谢流中物质平衡；保护性的阻止挥发性的中间代谢产物扩散，维持反应必要的底物；解决有毒的代谢通路中间产物带来的问题，比如与代谢反应竞争，减慢转化速率。自然环境下达到这点是通过区域化作用，造成生物反应的相对物理隔离。区域化的例子包括膜包合的细胞器，细菌的微小隔室，多酶复合体以及其他。受到这些自然系统的启发，合成生物学的研究者已经通过模仿天然系统，开始利用蛋白，核酸以及脂质来构建合成的组织排布系统，并且许多这样的系统已经应用于代谢通路并且表现出工业上和商业上重要化学产物产量的显著增长。

为了解决代谢工程中的这些问题，大自然已经进化出区域隔离化策略。例如细胞器和大的多酶复合体，在空间上组织代谢反应。真核生物中，区隔化普遍以膜包被的细胞器的形式存在。例如过氧化物酶体，将产生或者消耗过氧化氢的生化反应密封在内，过氧化氢本身是一种有毒的中间代谢产物，由打断有机底物的氧化反应产生。原核生物中，存在不同类型的细菌微小隔室，将细菌细胞的内部空间分隔成特定的功能区域。例如在蓝细菌和其他的自养型原核生物中，羧酶体封闭住1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBisCO)和碳酸酐酶(CA)，这些酶参与卡尔文循环的限速步骤。这些蛋白质的微小隔室是这些细菌主要的“碳－浓缩机制”，认为它们通过给酶提供较高的局部二氧化碳浓度，帮助细菌克服RuBisCO转化速率低的问题。