[发明专利]一种疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开了一种疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法，试剂盒包括：含有混合引物的PCR反应液I，含有分型探针的PCR反应液Ⅱ，Taq/UNG酶混合液，含有P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域序列的重组质粒的阳性对照，阴性对照；混合引物包括：用于扩增P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域的引物序列，用于扩增HBB基因的引物序列；分型探针包括：用于分型鉴定P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域序列，用于鉴定HBB基因的探针序列；本发明的设计可以对样本中的疟原虫进行检测并对四种疟原虫进行准确分型；本发明采用疟原虫线粒体cox3基因为目标基因进行检测，从而具有更高的特异性和灵敏。

技术领域

本发明涉及疾病检测辅助领域，特别是一种疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

疟疾，热带和亚热带地区广泛传播的传染性疾病，由寄生原生生物疟原虫的感染引起。可以感染人的四种疟原虫，含恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)及间日疟原虫(Plasmodiumvivax)。

此外，疟疾对国家和个人的财富具有负面影响。非洲每年因疟疾需花费高达上百亿美元，且每年至使其国内生产总值出现减缓。疟疾会导致生产力损失，使得社会陷入更深的贫困和对投资和旅游业造成负面影响。此外，由于疟疾对于五岁龄以下儿童的高死亡率，对社会结构也造成了较大的影响。

在许多疟疾流行的国家，快速和准确地诊断疟疾成为一项挑战。据世界卫生组织统计，每年有超过两亿确诊的疟疾病例，导致近一百万例死亡。在疟原虫属的四个种中，恶性疟原虫引起的疟疾危险度最高，死亡率最高，因此必须迅速鉴定且从其他对人类致病的疟原虫种中将其区分出来。

另外，大多数疟疾流行区典型的感染涉及两种或多种上述疟原虫的混合感染；这些混合感染经常难以被检测到或被低估。混合感染检测的失败会导致治疗不全面，以及可能会导致更为严重的疾病。因此，急需开发一种在疟疾流行区简便、快速、高灵敏度和种特异性的疟疾诊断方法。

目前疟疾诊断的金标准是血涂片的显微镜检。如果疟原虫密度很高，这种显微镜检具有相对较高的灵敏度和特异性并且能够确定疾病发展的阶段和感染种属。然而，当疟原虫密度较低的时，该方法则比较繁琐，需要训练良好的专家，并且可能导致治疗上的延误。

在一些无法开展标准实验室诊断的地区，为提高疟疾诊断的速度和精确性，研究者们开发了基于免疫反应的疟疾快速诊断试验。然而，该类产品的灵敏度有较大波动，并且只有针对恶性疟原虫的种特异性的产品。且当寄生虫密度较低、在混合感染期间、在药物治疗之后或在感染慢性期过程中的情形下需要较长的观察时间和通过显微镜检来验证诊断。因此，这种状况可导致假阴性结果或不可靠的诊断。

此外，还有针对的疟原虫18SrDNA的巢式PCR检测，由于疟原虫基因组的富含AT，使得该检测方法所需引物设计较为复杂，特异性较低且该方法需进行两轮扩增反应，操作较为繁琐。

总之，上述常用的疟疾诊断方法，存在检测的情况有限、操作比较繁琐、需要训练良好的专家或无法检测出疟原虫种属差异等问题；市场需要一种特异性强、灵敏度高的疟原虫核酸分型检测试剂盒，本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法，本发明的设计可以对样本中的疟原虫进行检测并对P.v、P.f、P.o、P.m四种疟原虫进行准确分型；本发明以疟原虫线粒体cox3基因为目标基因进行检测，相较于18SrRNA拷贝数更多，且cox3基因为线粒体基因，其免疫压力更小、突变率更低，从而本发明具有更高的特异性和灵敏度。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：