[发明专利]一种小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法

权利要求书

1.一种小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法，其特征在于，利用性成熟前小鼠睾丸组织细胞作为精原干细胞诱导分化的体外微环境，促进精原干细胞体外向精子分化；

性成熟前小鼠睾丸组织细胞为2w龄雄性小鼠睾丸组织，获得此阶段睾丸成纤维细胞用于支持小鼠经原干细胞体外精子分化；

将少量2w龄雄性小鼠睾丸成纤维细胞混合到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层中，构建体外诱导精原干细胞分化的体外微环境，支持精原干细胞体外向精子分化；

将1-5×10³个的2w龄雄性小鼠睾丸成纤维细胞接种到含0.5-1×10⁵个铺板的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层中培养1-2d后开始接入精原干细胞；

精原干细胞接种到体外精子分化微环境中培养2-3d，出现分化精原细胞，培养至14-15d，分化精原细胞进入减数分裂，随后产生圆形精子；

2w龄雄性小鼠睾丸成纤维细胞通过如下方法分离得到：

S1、取2w龄雄性小鼠睾丸，放入盛有PBS的培养皿中，并用PBS洗涤2-3次，除去血污；

S2、去掉睾丸白膜，将剩下的睾丸组织转移到10mL离心管，加入10倍体积的PBS，用吸管轻轻吸打，然后静置，待睾丸组织沉到离心管底后，弃掉上清液，如此反复洗涤2-3次；

S3、加入10倍体积的IV型胶原酶1mg/mL和20μg/mL的DNAse I联合消化，于37℃水浴锅消化6～10min，然后用吸管轻轻吹打，直到曲精细管分散开，并且保证曲精细管的完整性；

S4、加入5-10mL PBS，轻轻吹打，然后600rpm离心5min，弃上清，收集曲精细管，如此反复2次；

S5、加入5倍体积的0.25％胰酶-EDTA和20μg/mL的DNAase I混合消化，于37℃水浴锅中消化8-10min，用等量的10％FBS的DMEM/F12终止消化，用约60μm的细胞筛过滤细胞悬液，除去未消化完全的组织块；

精原干细胞体外精子分化的培养体系中所用培养基为：97％Stro-34培养基+1％ITS+55μM β-巯基乙醇+1％L-谷氨酰胺+2％FBS+1％双抗；

精原干细胞体外增殖的培养基为：95％Stro-34培养基+1％ITS+55μM β-巯基乙醇+1％L-谷氨酰胺+2％B27+20ng/mL GDNF+10ng/mL EGF+10ng/mL bFGF+1000IU/mL LIF+1％双抗。