[发明专利]一种小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法

说明书

本发明公开一种小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法，本专利根据睾丸发育特点，利用性成熟前小鼠睾丸组织细胞为精原干细胞分化精子的微环境，建立了促进精原干细胞体外高效向精子分化方法。本发明建立的小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法，是对比了不同阶段小鼠睾丸组织细胞状态和组成比例，通过实验方法最后优选出高效促进精原干细胞体外向精子分化的方法，该方法操作简单，重复性好，比目前建立精原干细胞体外分化精子的方法更具有优势，是精原干细胞体外分化研究技术的新突破，在后期科研和相关应用中有广泛的应用前景，同时对于其他物种精子体外分化和人类辅助生殖的研究也具有重要的参考价值。

技术领域

本发明涉及生殖干细胞领域，具体涉及一种小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法。

背景技术

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是一类存在于雄性动物体内生精小管内侧壁基底膜上能够维持自我更新和分化的细胞；通过自我更新维持生殖干细胞数量恒定；通过分化可以源源不断产生精子，保证雄性动物一生的正常的生殖能力。SSCs是雄性动物中唯一能将遗传信息传递给后代的干细胞，同时在体外是最容易转变为多能干细胞的成体干细胞，因此它是生殖医学、干细胞工程和发育生物学、动物转基因等方面的重要研究材料，具有极大的科研价值。

各类干细胞和生殖细胞体外诱导精子分化的技术，成为人类辅助生殖、濒危物种保护和转基因动物研究的一项重要亟待解决的技术。但成功建立高效体外诱导发育到功能精子的报道还很少。目前，主要依赖的方法是新生小鼠睾丸成纤维细胞以及添加多种诱导剂来实施，但仍然还存在成功率不高，可操作性不强的问题。

在成年动物睾丸中，成熟的支持细胞，生精小管的类肌细胞和生精小管之间的间质空间内存在的各级间质细胞以及其中的血管和淋巴管，是构成SSCs的微环境(“龛”：“Niche”)的重要组成部分，这个“Niche”调控着SSCs维持自我更新和源源不断的分化精子，是SSCs有序产生精子的保障。

体外获得有受精能力的生殖细胞一直都是生殖生物学和生殖医学领域的难题和热点。体外模拟睾丸组织内的“Niche”方法建立体外精子分化，是高效建立精子体外分化的突破点，日本生殖生物学家Takehiko Ogawa将摘除新出生两三天的幼鼠的睾丸，放置到一个含有专用培养基中体外组织培养，建立精子分化所需的体内“Niche”，移植进入的SSCs可以在体外分化成正常功能的精子。成为体外诱导精子分化研究的一个新方法；中国科学院动物研究所联合团队通过添加睾酮和等激素和利用睾丸细胞共培养的方法，最终成功的将小鼠ESCs诱导成精子样细胞；日本科学家Saitou通过联合联合过表达Blimp1、Prdm14和Tfap2c转录因子，获得外胚层干细胞来源的原始生殖干细胞，然后在通过移植到受体小鼠，利用受体小鼠睾丸体内微环境实现了精子分化。

精子发生过程相当复杂，呈现多步骤分化，不同物种之间也展现出了很大的差异，目前，特征性SSCs系也只有啮齿动物SSCs获得体外成功建系，成为生殖调控研究的最主要材料，而人和其他动物SSCs仍不能长期培养，一定程度上也限制了精子分化的研究，而利用其他类干细胞诱导精子，相对于SSCs，又增加了一定的难度。

因此，现有技术有待于进一步发展和改进。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一种小鼠SSCs体外向精子高效分化的方法，能够高效诱导SSCs体外精子分化，其技术方案如下。

本发明技术方案如下：

本发明提供一种小鼠SSCs体外向精子高效分化的方法，其中，利用性成熟前小鼠睾丸组织细胞构建SSCs诱导分化的微环境，促进SSCs向精子分化。

所述小鼠SSCs体外向精子高效分化的方法，其中，性成熟前小鼠睾丸组织细胞为2w龄雄性小鼠睾丸组织成纤维细胞，成为优选最佳构建体外微环境细胞时期。