[发明专利]一种同步检测3种菠萝凋萎相关病毒和菠萝杆状DNA病毒的多重RT-PCR检测方法

权利要求书

1.一种用于同步检测3种菠萝凋萎相关病毒和菠萝杆状DNA病毒的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：

用于特异性RT-PCR检测菠萝凋萎相关病毒-1的引物对I：

PMWaV-1-F：5'-TCCAAAGCTCTGTGGGAGTTGGGT-3'，

PMWaV-1-R：5'-ACGTTGTGTTCGCCAGAACCACT-3'；

用于特异性RT-PCR检测菠萝凋萎相关病毒-2的引物对II：

PMWaV-2-F：5'-TGGCAACAATCCCAACGGAAGC-3'，

PMWaV-2-R：5'-TCGCCGAATGGTTCATGAGGCT-3'；

用于特异性RT-PCR检测菠萝凋萎相关病毒-3的引物对III：

PMWaV-3-F：5'-AACCATGGGCGCACAAAACCAG-3'，

PMWaV-3-R：5'-CGCTCTCTTTACAAGATGCCAA-3'；以及

用于特异性RT-PCR检测菠萝杆状DNA病毒的引物对IV：

PBCoV-F：5'-TATCCTTGTATGCGTGCGTCTAC-3'，

PBCoV-R：5'-GCAGAGTTTCCAAAGTTTCGTCAC-3'。

2.一种同步检测3种菠萝凋萎相关病毒和菠萝杆状DNA病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测菠萝样品总RNA，并以RNA为模板反转录制备获得第一链cDNA；

2)以步骤1)中获得的cDNA为模板，利用权利要求1所述引物组合，进行特异性PCR扩增反应；

3)用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

3.根据权利要求2所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤1)具体为：提取待测菠萝样品总RNA，向RNase-free的反应管中加入菠萝样品总RNA模板5.0μL，10mM随机引物1.0μL，10mM dNTPs 1.0μL，缓冲液2×RT Buffer 10.0μL，M-MuLV反转录酶1.0μL，RNA酶抑制剂0.5μL和RNase-free Water 1.0μL，于42℃孵育1h，即获得第一链cDNA。

4.根据权利要求2所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中进行多重RT-PCR扩增使用的25μL PCR反应体系为：

步骤1)所得第一链cDNA溶液1μL，5U/μL Taq酶0.25μL，10×PCR buffer 2.5μL，2.5mMdNTP混合液2.5μL，10μm/μL上、下游引物各0.5μL和ddH₂O 14.75μL。

5.根据权利要求4所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min保存。

6.根据权利要求2所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤3)所述电泳具体为：取5μL PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳30min。

7.根据权利要求2所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，待测菠萝样品来自于菠萝的叶片、花、果实、芽或茎。

8.根据权利要求7所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，待测菠萝样品来自于菠萝的叶片、芽或地上茎。