[发明专利]一种同步检测3种菠萝凋萎相关病毒和菠萝杆状DNA病毒的多重RT-PCR检测方法

说明书

本发明提供一种同步检测菠萝植株各部位是否携带菠萝凋萎相关病毒‑1、菠萝凋萎相关病毒‑2、菠萝凋萎相关病毒‑3和菠萝杆状病毒的多重RT‑PCR方法及引物组合。该方法具有特异性强、操作简便、耗时较短、检测结果易辨别、检测灵敏度和效率高等特点，克服了常规分子检测目标单一、耗时较长、耗材较多、灵敏度不高、不适合大规模推广应用等不足，为菠萝病毒病的检测及防控预警提供一种技术可靠、易复制、适宜向基层部门和研究人员推广应用的快速检测方法。

技术领域

本发明涉及一种同步检测3种菠萝凋萎相关病毒和菠萝杆状DNA病毒的多重RT-PCR检测方法，属于病毒检测技术领域。

背景技术

病毒病是世界各菠萝主产区的重要病害之一。菠萝在生长过程中，常遭受到病毒危害，病毒病严重影响菠萝果品产量和品质，目前已成为世界各产区菠萝产业健康发展的制约因子之一。菠萝被病毒侵染后，终生带毒，病毒在植株体内增殖、扩散，干扰和破坏了害病植株的正常生理机能，造成害病植株不能正常营养生长和开花结果，最后根系枯死、地上部皱缩失水，叶片逐渐褪绿变黄后变红，后期整株凋萎、死亡，结果株长势减退、果实多畸形、畸小等，导致产量下降、果实品质变劣、品种退化，对菠萝产业造成极大经济损失，对菠萝经济栽培造成严重影响。染病母株抽生的吸芽、顶芽、裔芽等无性繁殖材料均带毒，存在进一步扩散为害的潜在威胁。目前，我国已发现和鉴定的菠萝病毒主要有：菠萝凋萎相关病毒-1(Pineapple Mmealybug Wilt-associated Viruse-1,PMWaV-1)、菠萝凋萎相关病毒-2(Pineapple Mmealybug Wilt-associated Viruse-2,PMWaV-2)、菠萝凋萎相关病毒-3(Pineapple Mmealybug Wilt-associated Viruse-3,PMWaV-3)和菠萝杆状DNA病毒(Pineapple Bacilliform Comosus Virus,PBCoV)等4种。研究表明，PMWaV-2和菠萝粉蚧(Dysmicoccus spp.)共同危害引起菠萝凋萎病(Pineapple Mealybug Wilt,PMW)，PMWaV-1和PMWaV-3在PMW的发展进程中也扮演着重要的角色。

PMW为害存在如下明显特点：一是病害样品常常呈现几种PMWaVs复合侵染的现象，而PBCoV与PMW发病虽无直接关系，但其往往伴随PMWaVs共同出现在PMW显症植株中。二是田间常存在“隐症发病”现象，假阴性率较高，田间难以通过观察症状判断未显症植株是否携带病毒；三是发病程度与土壤水分含量呈负相关关系，即土壤水分含量越高时显症越不明显、水分含量偏低时更易显症，同时存在部分轻症、中症植株在水分充足的条件下可恢复“健康”的情况，为田间辨别增加了难度；四是菠萝植株一经病毒侵染，便终生带毒，且由其萌发的吸芽、顶芽、裔芽等无性繁殖材料均不同程度带毒，田间无法辨别，易造成带毒苗扩散、传播，一定程度上为后续病害大范围、快速扩散提供便利条件，对健康种苗生产推广和产业发展存在较大的潜在威胁。因此，建立一种简便、快速、灵敏、精准的，可同步检测多种菠萝病毒的多重RT-PCR检测方法，应用于检测菠萝各组织和种苗是否携带病毒以及未来可期的菠萝无毒种苗繁育显得极为迫切和重要。