[发明专利]外泌体的提取方法

权利要求书

1.一种外泌体的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

用含无外泌体血清的培养基培养人脂肪来源间充质干细胞，得到培养上清液，所述培养上清液中含有外泌体；

将所述培养上清液进行第一离心处理后，取上清进行第二离心处理，然后取上清得到离心液；

将所述离心液用100KD超滤管进行超滤浓缩处理，得到超滤液；

将所述超滤液进行第三离心处理后，用0.22μm过滤器进行过滤除菌处理，得到浓缩液；

将所述浓缩液进行第四离心处理，弃上清得到所述外泌体；

其中，所述第一离心处理的离心力为600-1000g，所述第二离心处理的离心力为2000-2800g，所述第三离心处理的离心力为9000-11000g，所述第四离心处理的离心力为90000-110000g。

2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述第一离心处理的离心力为800g，所述第二离心处理的离心力为2500g，所述第三离心处理的离心力为10000g，所述第四离心处理的离心力为100000g。

3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述100KD超滤管为15ml的超滤管。

4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述超滤浓缩处理的条件为：离心力4000g，时间25min。

5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述含无外泌体血清的培养基包括：10％无外泌体血清、高糖DMEM和1％青霉素/链霉素。

6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述用含无外泌体血清的培养基培养人脂肪来源间充质干细胞的时间为24-48h。

7.如权利要求1-6任一项所述的提取方法，其特征在于，所述人脂肪来源间充质干细胞是：从脂肪组织中分离培养hADSCs得到第4代细胞后继续扩大培养得到融合度达80～90％的细胞。

8.如权利要求7所述的提取方法，其特征在于，所述从脂肪组织中分离培养hADSCs的方法包括：

收集脂肪组织样本，然后进行消化处理，得到消化液；

从所述消化液中收集含单个核细胞的液体后，移入完全培养基中终止消化，然后分离出原代人脂肪来源间充质干细胞；

将所述原代人脂肪来源间充质干细胞进行传代培养。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，用含有0.25％胰蛋白酶和0.1％I型胶原酶的消化液对所述脂肪组织样品中进行消化处理。

10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述完全培养包括：10％胎牛血清、高糖DMEM和1％青霉素/链霉素。