[发明专利]外泌体的提取方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种外泌体的提取方法。该方法包括如下步骤：用含无外泌体血清的培养基培养人脂肪来源间充质干细胞，得到培养上清液，所述培养上清液中含有外泌体；将所述培养上清液进行第一离心处理后，取上清进行第二离心处理，然后取上清得到离心液；将所述离心液用100KD超滤管进行超滤浓缩处理，得到超滤液；将所述超滤液进行第三离心处理后，用0.22μm过滤器进行过滤除菌处理，得到浓缩液；将所述浓缩液进行第四离心处理，弃上清得到所述外泌体。该方法可高效地从人脂肪来源间充质干细培养上清液中提取到高浓度、高纯度的外泌体。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种外泌体的提取方法。

背景技术

皮肤作为人体最大的器官总是会受到各种物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭。皮肤的抗氧化、抗衰老、抗炎及损伤修复是临床医师非常关心的研究问题。

人脂肪来源间充质干细胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)是一类存在于脂肪组织中，具有自我更新和多向分化潜能的干细胞。通过旁分泌作用于成纤维细胞以及分泌促进其分泌1、2型的胶原和纤连蛋白，促进胶原合成，以发挥抗衰老、抗氧化作用；除此之外，hADSCs在不同的诱导因子作用下可以分化成脂肪细胞、成骨细胞、肌细胞、神经细胞，而且还可以能分泌多种促进细胞成熟的细胞因子和促进血管生成的因子，这些表明hADSCs具有抗炎、损伤修复的作用。因此，实际应用中，比如整形美容上，可以用hADSCs来除皱、瘢痕和疤痕的直接注射；另外，因为各种炎症、溃疡、烧伤等造成的皮肤损伤修复问题也有望通过hADSCs来解决。

外泌体(Exosomes)是一种被大多数细胞分泌的微小膜泡；近年来，外泌体凭借其大小及双分子膜等优势在多种疾病模型中呈现出了较细胞水平更为卓越的治疗效果。随着外泌体研究增多，人脂肪来源间充质干细胞外泌体的相关研究也日益增多。然而，现有提取hADSCs及外泌体方法需要大量脂肪组织和细胞，存在价格昂贵、费时费力的缺点。比如提取脂肪干细胞方法常使用机械设备，使得脂肪干细胞提取的细胞活力收到损伤，消化液也会损伤提取出来的脂肪干细胞，而且步骤冗杂。因此，要想获得高质、高量的脂肪干细胞，必须建立一套更简便有效的分离培养方法。

而外泌体领域的研究时间尚短，存在多种问题，如外泌体的提取方法学规范、统一定量及鉴定等。关于外泌体的提取有超速离心、试剂盒、超滤法、蔗糖密度梯度离心等，然而各种方法均有其利弊。超速离心法是目前外泌体相关文章中的主流方法，由于离心步骤繁琐，费事费力，而且步骤多导致实验中容易污染，且损耗量大，使得最终回收的外泌体不稳定。而且对于抽提细胞上清来说，更是极为不请便，试想用提取300ml的上清需要6个50ml离心管，无论是过滤还是后续的每一步的离心去沉淀，都具有操作极其不便的缺点，总之非常麻烦。而超滤法存在外泌体会堵塞膜孔，造成浓缩效率低，浓缩管重复利用差，甚至堵塞在膜孔的外泌体还可能会粘连成团，造成损失及最后的数据有误差，对于后续实验也有影响；最后浓缩液中外泌体的浓度不稳定，为后续实验操作和分析来带困扰等缺点。

因此，现有技术有待改进。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种外泌体的提取方法，旨在解决现有外泌体提取步骤繁琐、成本高，以及提取效果不稳定的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供一种外泌体的提取方法，包括如下步骤：

用含无外泌体血清的培养基培养人脂肪来源间充质干细胞，得到培养上清液，所述培养上清液中含有外泌体；

将所述培养上清液进行第一离心处理后，取上清进行第二离心处理，然后取上清得到离心液；

将所述离心液用100kd超滤管进行超滤浓缩处理，得到超滤液；