[发明专利]一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种在GenBank登录号为AY297842的马铃薯X病毒弱毒疫苗，其特征在于，为含有改造后的马铃薯X病毒cDNA的侵染性克隆或重组菌，所述改造后的马铃薯X病毒cDNA中编码三基因盒蛋白2的GGXYXDGTK基序的核苷酸序列全部被敲除，所述GGXYXDGTK基序中X为任意一种氨基酸，所述重组菌的宿主菌为农杆菌；所述改造后的马铃薯X病毒cDNA序列如SEQ IDNO：1所示；所述侵染性克隆所用的表达载体为pGR107。

2.根据权利要求1所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗，其特征在于，所述农杆菌为带有pSOUP辅助质粒的农杆菌GV3101。

3.权利要求1-2任意一项所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)获取马铃薯X病毒基因组全长cDNA；

2)构建马铃薯X病毒弱毒疫苗：对上述全长cDNA中编码三基因盒蛋白2的GGXYXDGTK基序的核苷酸序列进行敲除，构建到表达载体中获得改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆；或者将改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆转化宿主菌，获得重组菌，即为马铃薯X病毒疫苗；所述宿主菌为农杆菌。

4.根据权利要求3所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆的构建方法如下：

a.以带有马铃薯X病毒基因组cDNA的pGR107侵染性克隆为模板，经PCR扩增获得马铃薯X病毒基因组cDNA的3919-5350nt，记为序列A，核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；经PCR扩增获得马铃薯X病毒基因组cDNA的5276-6158nt片段，记为序列B，核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；其中，序列A和序列B均全部缺失编码GGXYXDGTK基序的核苷酸，即缺失马铃薯X病毒基因组cDNA 5300-5326nt片段，序列A的3′末端和序列B的5′末端存在48nt的重复序列；

b.将序列A和序列B通过线性PCR反应进行连接；以线性PCR产物为模板，PCR扩增获得序列C，核苷酸序列如SEQ ID No：4所示；

c.用限制性内切酶AvrII和HpaI对带有马铃薯X病毒基因组cDNA的pGR107侵染性克隆进行酶切，回收大小为8892nt的片段，记为序列D；

d.将序列C插入至序列D中，构建完全敲除三基因盒蛋白2中编码GGXYXDGTK基序的核苷酸的马铃薯X病毒突变体，命名为PVX-TGBp2Δ_52-60，即为侵染性克隆。

5.根据权利要求4所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤a中所述序列A扩增用的引物对如SEQ ID No:5和SEQ ID NO：6所示；所述序列B扩增用的引物对如SEQ ID No:7和SEQ ID NO：8所示；步骤b所述序列C扩增用的引物如SEQ ID No:5和SEQ IDNO：8所示。

6.根据权利要求4所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤d中所述序列C通过Gibson组装的方法插入至序列D中。

7.权利要求1-2任意一项所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗在防治野生型强毒马铃薯X病毒中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述含有改造后的马铃薯X病毒cDNA的重组菌导入植物，使植物接种马铃薯X病毒弱毒疫苗，所述植物为马铃薯X病毒的寄主植物，包括马铃薯、番茄、辣椒、烟草、黄瓜和西瓜。