[发明专利]一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用

说明书

一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用,植物病毒疫苗技术领域。本发明针对目前马铃薯X病毒属病毒弱毒疫苗存在的保护品种受限，易回复突变的问题，通过分子生物学技术手段完全敲除马铃薯X病毒中编码“GGXYXDGTK”氨基酸基序(其中，X为任意一种氨基酸)的核苷酸序列，获得一种改造的弱毒疫苗，缺失该段多肽的改造病毒具有系统侵染植物的能力，且不会引起和健康对照植物相比可分辨的病毒症状。本发明适用于植物弱毒疫苗的开发和利用。

技术领域

本发明涉及植物病毒疫苗技术领域，提供了一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

利用低致病力(弱毒)的植物病毒来防治高致病力株系在农业上具有重要的应用价值。目前，弱毒株系主要通过以下几种方式获得：

1)从自然环境中筛选获得弱毒株系；例如：REGULES Miguel ARANDASempereRaquel Pedro Jesús Use of twoisolates of pepino mosaic virus to protectagainst infection by the same virus(EP3309256A1)；Schenk MF,Hamelink R,van derVlugt RAA,Vermunt AMW,Kaarsenmaker RC,Stijger,ICCMM.2010,The use ofattenuated isolates of pepino mosaic virus for cross-protection.Europeanjournal of plant pathology,127:249-261。

2)人工改造病毒氨基酸获得弱毒株系。例如：李向东，丛倩倩，王莹，郭兆奎，李现道，马铃薯X病毒弱毒株系的筛选及在交叉保护中的应用(CN 103820400B)；ChewachongGM,Miller SA,Blakeslee JJ,Francis DM,Morris TJ,Qu F.2015.Generation of anattenuated,cross-protective pepino mosaic virus variantthrough alignment-guided mutagenesis of the viral capsid protein.Phytopathology 105:126-134.

上述方法中，从自然界分离的弱毒系可能仅在少数作物品种上具有保护功能，而在其它品种或作物上并不是弱毒株系，而且存在逃逸的风险；人工改造病毒氨基酸获得弱毒株系存在回复突变为强毒株系的可能。

发明内容

针对现有技术制备的马铃薯X病毒属病毒(potexviruses)弱毒疫苗存在的保护品种受限，易回复突变的问题，本发明提供了一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用。

本发明提供了一种通过敲除马铃薯X病毒中编码“GGXYXDGTK”的核苷酸序列，获得低复制能力、弱毒性的马铃薯X病毒弱毒疫苗的方法。

本发明所述马铃薯X病毒弱毒疫苗为含有改造后的马铃薯X病毒cDNA的侵染性克隆或重组菌，所述改造后的马铃薯X病毒cDNA中编码三基因盒蛋白2的GGXYXDGTK基序的核苷酸序列全部被敲除，所述GGXYXDGTK基序中X为任意一种氨基酸，所述重组菌的宿主菌为农杆菌。

进一步地限定，所述改造后的马铃薯X病毒cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地限定，所述农杆菌为带有pSOUP辅助质粒的农杆菌GV3101。

进一步地限定，所述侵染性克隆所用的表达载体为pGR107。

本发明还提供了所述马铃薯X病毒弱毒疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1)获取马铃薯X病毒基因组全长cDNA；