[发明专利]一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法

说明书

本发明公开了一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法，该方法在无菌条件下通过温度控制与营养元素互作，实现了牡丹胚的高效生根，为组织培养提供了合适的外植体，并可为相关研究(如快速成苗、根部营养吸收规律等)提供可控的研究体系和材料。本发明首次发现特定的培养温度与钙可有效互作，协同促进牡丹胚的高效生根，同时明确了牡丹胚生根所需的培养基及温度，整个过程简单高效、可操作性强，具有较大的推广应用前景。

技术领域

本发明属于植物生根技术领域，具体而言，涉及一种牡丹无菌生根的方法，尤其涉及一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法。

背景技术

牡丹(Paeonia suffruticosa)是属于芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)的一种多年生灌木植物，是世界著名花卉，也是中国十大名花之一，具有较高的观赏价值，同时兼具药用和油用价值。其中，油用牡丹是指种籽含油率较高(大于或等于22％)的一类牡丹的总称，以其压榨的牡丹籽油富含不饱和脂肪酸，且α-亚麻酸含量高达42％，被称为“液体黄金”。油用牡丹耐干旱，能够种植在非耕性的荒山荒坡上，同时在水土保持，防风固沙，改善土壤品质等方面具有重要作用，因此也具有较广阔的推广应用前景。目前，油用牡丹已经具备一定的种植规模，但事实上该产业的经济效益和前景并不乐观，主要原因在于牡丹应用和基础方面的研究不够深入，科技创新性较低，不能为产业发展提供有效服务。

农业生产上普遍采用播种方法对牡丹进行育苗和良种扩繁，但是牡丹种子存在基因杂合度高以及生根困难等问题。由于牡丹种子存在胚休眠现象，通常需要3个月左右才能萌发生根，成苗则需要更长的时间；在其它植物中普遍采用组培快繁技术进行扩繁的方法，在油用牡丹中上尚未成熟，主要原因在于缺乏合适的外植体，消毒后的外植体在后续培养中表现出褐化率高、污染率高和诱导率低等问题，严重影响着油用牡丹的育种周期及产业发展。如果能够在无菌条件下，实现牡丹胚的高效生根，将为组织培养提供合适的外植体，并可为相关研究(如根部的营养吸收规律、快速成苗)提供可供的研究体系和材料。到目前为止，现有技术还未针对无菌条件下，油用牡丹胚生根的问题提出简单有效的处理方法，然而该方法对于油用牡丹的深入研究和产业化开发具有重要的现实意义。

通过检索国内外现有技术，目前尚未发现无菌条件下，通过温度控制与营养元素互作有效提高牡丹胚生根率和生根质量的简易方法。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法，以克服生根率低和褐化率高的问题，从而填补无菌条件下牡丹胚生根技术的空白。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索。本发明人首先考虑在培养基中加入激素打破牡丹胚休眠，促进其生根，但效果不太理想。例如：BA(苄氨基嘌呤，benzylaminopurine)能打破上胚轴休眠，但对下胚轴萌发有明显的抑制作用；NAA(萘乙酸，naphthlcetic acid)能诱导愈伤，IAA(吲哚-3-乙酸，indole-3-acetic acid)能促进胚膨大，但都不利于生根；GA(赤霉素，gibberellin)能打破上下胚轴的休眠，但根较为细弱。大量的试验后发现，在‘凤丹’中使用激素后最优的生根率仅仅约为90％，与其它品种中的100％的生根率还有较大差距。

令人意外的是，试验研究过程中发现一个不添加激素的对照组，却表现出非常理想的生根率，进一步的研究中发现，特定的培养温度与钙可以有效互作，从而协同促进牡丹胚的高效生根。因此本发明人另辟蹊径，最终获得了如下技术方案：一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法，该方法包括如下步骤：

(1)选取花后100～150d的牡丹种子；

(2)将牡丹种子用流水冲洗干净后，置入杀菌剂溶液中浸泡5～15min，蒸馏水冲洗，再置入400～600mg·L^-1的GA溶液中浸泡15～30h，收集下沉种子，蒸馏水冲洗干净后置于无菌容器中；

(3)在无菌环境下，将种子消毒处理，然后采用无菌水清洗3～8次；