[发明专利]郁金香基腐病菌LAMP可视化检测方法

说明书

本发明公开了一种检测郁金香基腐病菌的LAMP引物对及其检测方法，属于植物病原真菌检测领域，自行设计合成了1套引物(Fot‑F3、Fot‑B3、Fot‑FIP和Fot‑BIP)。优化反应体系及扩增程序，建立了一种特异性强、快速准确并且可视化的植物及植物产品中郁金香基腐病菌基因组DNA的检测方法，一个工作日内完成整个检测，用于对郁金香基腐病菌的LAMP可视化检测。

技术领域

本发明涉及使用LAMP技术检测植物及植物产品中郁金香基腐病菌的方法，属于植物病原真菌检测领域。

背景技术

郁金香基腐病菌（Fusarium oxysporum f.sp. tulipae）能够引起的郁金香种球腐烂病害。病害发生在种球储藏期和生长早期，导致种球和植株的腐烂死亡，失去经济价值。郁金香基腐病能够土壤传播，病害一旦传入很难根除，远距离传播主要靠带菌的郁金香种球，在运输和储藏过程中，种球间的挤压接触也能造成病害传播。

郁金香基腐病菌引起的病害在郁金香种植生产中危害严重，是近年来我国进境口岸重点关注的病害之一。

郁金香基腐病菌也被称为尖镰孢菌郁金香专化型病菌（Fusarium oxysporumf.sp. tulipae），镰刀菌属的真菌在分类鉴定方面主要通过观察菌落、分生孢子、分生孢子梗、厚垣孢子的有无等形态特征来进行鉴定。病原菌菌株培养时间需约7天才能观察相关形态特征，镰刀菌属真菌在形态鉴定方面具有较大难度，需要鉴定人员具有较高的专业水平。目前的检测方法不能满足口岸检测“快验快放”的要求，尤其对于基层部门现场开展的检测工作。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本学者Notomi等于2000年开发的一种新型恒温核酸扩增方法。该技术与PCR相比优势明显，除了高特异性和高灵敏度外，实验操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅就能实现整个检测过程，适合高通量的病原微生物检测。同时，该技术抗干扰能力较强，使用的样品可以是未经提纯处理的，为基层部门现场开展检测工作提供了很好的技术支持。目前还没有将LAMP技术应用于郁金香基腐病菌检测的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：设计郁金香基腐病菌的LAMP特异引物，建立郁金香基腐病菌的LAMP可视化检测方法。

为了解决该问题，本发明的解决方案是，设计郁金香基腐病菌的特异LAMP引物，用于郁金香基腐病菌基因组DNA的特异性检测。郁金香基腐病菌的LAMP特异引物，序列如下：

Fot-F3: 5’- ACCTGATCCGAGGTCAACAT

Fot-B3: 5’- CAGTATTCTGGCGGGCATG

Fot-FIP: 5’- CACGTCGAGCTTCCATAGCGT-AGAAGTTGGGGTTTAACGGC

Fot-BIP: 5’- TGAGGAACGCGAATTAACGCGA-GTTCGAGCGTCATTTCAACC

反应结束后，在扩增产物中加入SYBR Green I荧光染料观察颜色变化，反应液颜色由橙色变成绿色为阳性，否则颜色保持不变。

一种检测郁金香基腐病菌的LAMP引物对及其扩增方法和用途，包括下述的扩增体系和扩增程序：

（1）扩增体系