[发明专利]重组恶臭假单胞菌的构建及其在生产丙酸中的应用

说明书

本发明公开了重组恶臭假单胞菌的构建及其在生产丙酸中的应用。本发明提供了一种制备重组菌的方法，包括如下步骤：缺失或者失活假单胞菌基因组上prpC基因，得到的重组菌。本发明以苏氨酸为原料，以重组的恶臭假单胞菌KT2440为工程菌，生产丙酸。此方法既可以避免化学合成法高温高压、强酸强碱对环境的污染，又能够解决微生物发酵法产生甲酸乙酸等副产物的弊端，从而提供了一种具有重要前景的生物转化法合成丙酸的技术路线。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组恶臭假单胞菌的构建及其在生产丙酸中的应用。

背景技术

丙酸(Propionic acid，PA),是一种有较强刺激性气味的无色透明的液体,可以以任意比例溶于水和乙醇等溶剂，有羧酸的典型的化学性质,分子式为C₃H₆O₂。丙酸及其衍生物在工业上的应用领域十分广泛，主要应用于食品防腐、饲料储藏、医药中间体合成、农业除草剂合成、有机合成中间体等方面。(1)面包、糕点等食品中添加丙酸钠也能起到很好的防腐作用，新鲜的粮食谷物含水量较大，使用丙酸钙作防腐剂，既能防腐、防结块，还能防止蛋白分解，保持营养成分；(2)由丙酸合成的一氯丙酸和一二氯丙酸钠，作为农业除莠剂能起到很好的除莠效果；(3)丙酸和异戊醇合成的丙酸异戊酯可作为香精合成的中间体，也可用作人造花精油的合成；(4)丙酸钙、丙酸钠作为医药成分，可用于治疗皮肤寄生性霉菌引起的皮肤病；(5)由丙酸合成的丙酸甲酯、3-氯丙酸、丙酸乙酯等都可以作为有机合成的中间体；(6)由丙酸合成的醋酸丙酸纤维素，可用于电视机、汽车零件等方面。

丙酸的生产方法有化学合成法和微生物发酵法，化学合成法是以石油等化工产品为原料，经过加温、加压利用催化剂合成丙酸的方法，该方法是工业级规模上丙酸的主要生产方法。常用的化学合成法有丙醛氧化法、轻质烃氧化法、乙醇羰基化法、乙烯羰基化法、丙烯腈法等。(1)丙醛氧化法：该法以丙醛为原料，乙酸钴为催化剂，六偏磷酸钠为助催化剂，将丙醛氧化可制备丙酸；(2)轻质烃氧化法：该法以轻质石脑油、液化天然气或沸点低于100℃的C4-C8烷烃为原料，用环烷酸锰等油溶性盐类为催化剂，在160-170℃、2.03-4.05M Pa下进行氧化反应，生成乙酸,同时副产丙酸、甲酸等；(3)乙醇羰基化法：该法以活性炭负载的Ni-Cu双金属作为反应催化剂，以乙醇为原料进行气相羰基化；(4)丙烯腈法：该法采用第Ⅵ-Ⅷ族金属的硫化物或其混合物为催化剂，在适宜的温度和压力下使丙烯腈与氢和水反应生成丙酸。

由于微生物发酵生产丙酸能降低对石油等不可再生能源的依赖性，减轻对环境造成的压力。因此，在当前全世界面临环境污染、能源短缺的严峻情况下，微生物发酵法生产丙酸为丙酸合成提供了新的思路，同时得到了越来越多研究者的关注。微生物发酵法是以微生物把一般营养源通过自身代谢产生丙酸，生物合成丙酸主要通过以下三条途径。(1)丁二酸途径：又名二羧酸途径，以葡萄糖、甘油、乳酸等为原料出发，发酵生产丙酸。其中关键步骤是丙酮酸和甲基丙二酰CoA通过草酰乙酸转羧基酶(EC6.4.1.1)的催化，生成草酰乙酸和丙酰CoA。另一个关键步骤是丁二酸和丙酰CoA通过CoA转移酶(EC2.8.3.5)的催化，生成丁二酰CoA和终产物丙酸。这条途径的缺点是会产生乙酸副产物，丙酮酸经过丙酮酸脱氢酶的作用生成乙酰CoA，然后进一步生成乙酸；(2)丙烯酸途径：是乳酸经过丙酰CoA转移酶(EC2.8.3.1)、乳酰CoA脱氢酶(EC4.2.1.54)和丙烯酰CoA还原酶(EC1.3.1.95)的催化，最终生成丙酸的过程。这条途径的缺点是能量不足，乳酸到丙酸的还原过程需要能量；(3)丙二醇途径：在一些细菌中，碳源首先发酵产生1,2-丙二醇，然后1,2-丙二醇在丙二醇脱氢酶(EC4.2.1.28)的作用下生成丙醛，然后丙醛通过丙醛脱氢酶(EC1.2.1.87)生成丙酰CoA，最后生成终产物丙酸。这条途径的缺点是会产生丙醇副产物，丙醛经过丙醇脱氢酶的作用会直接生成丙醇。