[发明专利]同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量PCR的引物和探针

说明书

本发明涉及一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量PCR的引物和探针、检测试剂盒以及检测方法。该引物和探针基于牛流行热病毒序列自5’端第3413～3518位碱基和牛呼吸道合胞体病毒序列自5’端第1847～1988位碱基作为检测序列设计得到。利用本发明的检测操作简便、特异性强、灵敏度高，将在牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的检测、毒株鉴定及疫苗生产中发挥作用。

技术领域

本发明属于动物病原检测领域，涉及检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的方法，特别涉及一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量PCR的引物、TaqMan探针、包含该引物和探针的检测试剂盒以及该引物、探针和试剂盒在检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒中的应用。

背景技术

牛流行热(Bovine ephemeral fever，BEF)是由牛流行热病毒(Bovine ephemeralfever virus，BEFV)引起的肉牛、奶牛、黄牛以及水牛的一种急性、非接触型传染病。该病是由节肢动物传染，呈周期性流行，广泛分布于亚洲、非洲和大洋洲地区。根据其流行特点又称为暂时热、僵硬病、三日热。该病特征是突然高热，呼吸急促，消化机能障碍，跛行，僵硬全身虚弱。牛流行热病毒属于弹状病毒科、暂时热病毒属，为单股负链RNA病毒，大小约14900bp，成熟病毒粒子长100～230nm、宽45～100nm，含有10个开放阅读框，3’到5’端依次为3’-N-P-M1-M2-G-GNS-α1-α2-α3-β-γ-L-5’，所编码的蛋白中5种为结构蛋白，分别是核蛋白(nucleo protein，N)、聚合酶交联蛋白(polymerase associate protein，P)、聚合酶相关蛋白(large RNA-dependent RNA polymerase，L)、基质蛋白(matrix protein，M)、糖蛋白(surface glycoprotein，G)。其它为非结构蛋白。该病毒对热敏感，56℃、10min或者37℃、18h即可将病毒灭活，pH 2.5以下或pH 8.0以上数十分钟内即可将病毒灭活，并且对氯仿、乙醚等敏感。

牛呼吸道合胞体病(Bovine respiratory syncytial，BRS)是由牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus，BRSV)引起的一种急性、热性呼吸道传染病，主要症状为高热、咳嗽、流鼻涕和流涎等症状，是引起牛等反刍动物的呼吸道疾病的主要病原之一。该病呈世界性分布，对养牛业危害极大。据报道，15～18月龄牛发病率高达80～100％，一些牛场的病死率为5～20％，对养牛业造成了很大的经济损失。欧盟许多国家将该病列为仅次于牛病毒性腹泻(BVD)和传染性鼻气管炎(IBR)的第三大疾病。因此，牛呼吸道合胞体病的诊断即成为了国内外兽医界关注的重点。牛呼吸道合胞体病毒属于副粘病毒科肺病毒属，研究表明牛呼吸道合胞体病毒与人呼吸道合胞体病毒相似，病毒呈球状或丝状，病毒粒子大小为80～860nm，有囊膜，为单股负链RNA病毒，大小为15～16kb，含有10个开放阅读框，编码11种蛋白，其中核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)、磷蛋白P、大聚合酶蛋白L为核衣壳蛋白，融合蛋白(Fusion protein，F)、附着蛋白(Attachment protein，G)、小疏水蛋白(Small hydrophobic protein，SH)为跨膜蛋白，还有3种非糖基化的基质蛋白(Matrix protein，M)，其余为非结构蛋白。

目前，国内外常用的实验室检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的方法主要是血清学实验，包括血清中和实验、补体结合实验、免疫荧光检测、酶联免疫吸附试验和分子生物学诊断等几大类，其中分子生物学诊断中的实时荧光定量PCR检测技术以其快速、简便、准确等优点成为快速发展的检测手段。