[发明专利]一种使用单细胞打印机进行单细胞分选的方法

说明书

本发明公开一种使用单细胞打印机进行单细胞分选的方法，包括：1)样本准备：将传代培养的CHO‑K1细胞离心5min，使用无菌Dulbecco's磷酸盐缓冲液或者传代培养基重悬，使细胞密度为1E6cells/mL；2)液滴调整参数设置：启动单细胞打印机的液滴质量控制，设置触发延迟为3ms，深度为10μm，速度为120μm/ms；3)分选参数设置：设置细胞直径12μm‑18μm、细胞圆度55％‑100％以及细胞检测半径为60μm；4)分选：将单细胞打印机的墨盒中的细胞样本分选到孔板中，每孔分选1个细胞。本发明的方法能使提高单细胞分选效率以及单克隆的恢复率，相比现有技术中的CHO‑K1细胞其他分选和培养条件有显著的进步。

技术领域

本发明属于生物制药和生物技术领域，特别是涉及使用单细胞打印机进行单细胞分选的方法，可应用于生产用细胞株的构建。

背景技术

单克隆抗体等生物药是近年来研发越来越火热的领域，随之而来的相关法规的要求也是越来越严格。对于生产用稳定细胞株构建，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese HamsterOvary，CHO)是最常用的宿主细胞之一。为了保证生物药的安全性，监管部门对生产用细胞株的单克隆性的要求非常高，因此，细胞单克隆化是整个细胞株构建过程中非常关键的步骤。

目前，细胞单克隆化常用的两种方法是有限稀释法和流式细胞仪分选。有限稀释法是一种较常规的方法，通过将细胞逐步稀释至很低的密度并铺板于96孔板中，同时结合Cell Metric(Solentim)等成像仪器，可以获得较高的单克隆率。由于低密度铺板，一块96孔板中的有效孔数目较少，需要增加铺板数目，比较耗费时间和人力，所以有限稀释法的效率比较低。流式细胞仪分选单细胞是一种相对高效的方法，通过对细胞内或者对细胞分泌产物进行荧光染色，从而有效的将单细胞分选至96孔板。该方法相较于有限稀释法，减少了非单细胞孔的数目，提高了单克隆率。同时流式细胞仪的清洁流程已经验证，以避免污染和交叉污染，能够保证细胞株的单克隆性。但是流式细胞仪的清洗流程繁琐，操作复杂，当同时有多个样品进行单细胞分选时，需要完成一个样品的单细胞分选及完整的清洗步骤之后才能进行下一个样品的分选，导致分选的操作效率降低。并且所用相关耗材配件价格昂贵，仪器需要专人负责维护。

单细胞打印机(Single-Cell Printer，Cytena)技术是一种新型的单细胞分选技术。单细胞打印机是利用微流体技术和实时图像分析将单个细胞分选并沉积到标准微孔板中。与喷墨打印技术类似的创新墨盒用于单向分配。当细胞分配时捕获五个图像，提供单细胞分离的证据。它能够通过高分辨率成像快速的区分单细胞，多细胞，无细胞和碎片，轻松区分单细胞。该方法进行单细胞分选要比有限稀释法具有更高的效率，并且具有比流动分选更高的活力。同时单细胞打印机采用一次性无菌墨盒，独立包装，以避免样品之间的交叉污染。单细胞打印机相对流式细胞仪，使用过程中不需要清洗仪器，操作更加快速和简单，也无需消耗昂贵的耗材，无需专人维护仪器，降低了时间、经济和人力成本。但是，单细胞打印机的单细胞分选效率和单克隆的恢复率受到细胞分选和培养条件的影响很大，不同细胞的分选和培养条件差异化显著，因此，探求某种特定细胞的合适的分选和培养条件以提高单细胞分选效率以及单克隆的恢复率，是本领域技术人员需要解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种使用单细胞打印机进行单细胞分选的方法，以进一步提高单细胞分选效率以及单克隆的恢复率。

为解决上述技术问题，本发明提供一种单细胞分选的方法，包括以下步骤：

1)样本准备：将传代培养的CHO-K1细胞离心5min，使用无菌Dulbecco's磷酸盐缓冲液(D-PBS，Hyclone SH30028.02)或者传代培养基重悬，使细胞密度为1E6cells/mL；然后再使用40μm的过滤器将重悬后的细胞悬液过滤，待用；

2)单细胞打印机的液滴调整参数设置：启动单细胞打印机的液滴质量控制，设置触发延迟为3ms，深度为10μm，速度为120μm/ms；