[发明专利]一种使用Namocell单细胞分离仪进行单细胞分选的方法

说明书

本发明公开一种单细胞分选的方法，包括以下步骤：1)样本准备：将待分选的CHO‑K1细胞用传代培养基稀释至1E5cells/mL的活细胞密度，加入钙黄绿素试剂染色；染色完成后，使用传代培养基将细胞稀释至5000cells/mL；2)样品加载：启动Namocell单细胞分离仪，将细胞注入到芯片腔体中，然后加载待检测芯片，3)位置校准：调整激光光斑至微流体通道中心位置；4)单细胞分选参数设置：设置荧光值为：FITCH＝500，FITCL＝30，PEH＝3，PEL＝0；5)单细胞分选：开始分选单细胞，通过高速电子阀门精确捕获活性细胞，并最终形成1μL体积的液滴，分选至孔板中，每孔分选1个细胞。本发明的方法能使提高单细胞分选效率以及单克隆的恢复率，相比现有技术中的CHO‑K1细胞其他分选和培养条件有显著的进步。

技术领域

本发明属于生物制药和生物技术领域，特别是涉及使用Namocell单细胞分离仪进行单细胞分选的方法，可应用于生产用细胞株的构建。

背景技术

单克隆抗体具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，目前已经成功用于治疗免疫、癌症等多种疾病领域。用于生产单克隆抗体的稳定细胞株，一般是通过哺乳动物表达系统来筛选得到的，其中中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)是最常用的宿主细胞之一。为了保证生物药的安全性，监管部门对生产用细胞株的单克隆性有着非常严格的要求，因此，细胞单克隆化是整个生产用细胞株构建流程中非常关键的一个步骤。

细胞单克隆化常采用的手段包括以下：半固体培养基挑选法、有限稀释法、流式细胞仪分选法、Namocell单细胞分离仪分选法。

半固体培养基挑选法：将细胞接种于半固体培养基(加入了识别目标产物的荧光标记抗体)中，待数天后单个细胞会形成一个群落。结合ClonePix(Molecular Devices)等仪器，通过至少两轮实验可以达到较高的单克隆率，但是增加了时间和经济成本。

传统的有限稀释法：将细胞逐步稀释至很低的密度接种于96孔板中，结合CellMetric(Solentim)等成像仪器，通过一轮实验可以获得较高的单克隆率。但是由于该方法铺板时非单细胞孔较多，细胞恢复有限，所以有限稀释法也是一种效率较低的单克隆方法。

流式细胞仪分选法：该方法借助于细胞内的荧光标记，或者对细胞分泌产物进行荧光染色，能有效地分选出表达量高的克隆，大大的提高了分选效率和单克隆率。不足之处在于鞘液的压力对细胞有一定的伤害，所使用的耗材价格昂贵，仪器的清洗过程复杂繁琐且费时间，还需要专人负责维护，耗费经济、时间和人力成本。

Namocell单细胞分离仪分选法：采用微流控技术，能够在一个温和的低压力环境下，同时利用激光激发，荧光接收的检测原理，快速的完成细胞的分选，减少对细胞的伤害，确保细胞的活性与功能。该仪器具有高效的分选能力，可以在1分钟内分离一块96孔板。采用了一次性无菌芯片，可以保证无菌分选，避免样品之间的交叉污染。而且该仪器价格适中，操作简单，无需专人维护。综上，使用Namocell单细胞分离仪分选单细胞，具有高效、无菌、操作简单、经济实惠等优点。但是，Namocell单细胞分离仪的单细胞分选效率和单克隆的恢复率受到细胞分选和培养条件的影响很大，不同细胞的分选和培养条件差异化显著，因此，针对某种特定细胞的开发合适的分选和培养条件以提高单细胞分选效率以及单克隆的恢复率，是本领域技术人员需要解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种使用Namocell单细胞分离仪进行单细胞分选的方法，以进一步提高单细胞分选效率以及单克隆的恢复率。

为解决上述技术问题，本发明提供一种单细胞分选的方法，包括以下步骤：