[发明专利]一种蛋白分离纯化的方法

说明书

一种蛋白分离纯化的方法，属于蛋白纯化技术领域。本发明为了能够大剂量纯化出纯度较高的蛋白，本发明提供了一种蛋白分离纯化的方法，包括如下步骤：制备正电荷分子筛：将不带电荷的分子筛树脂与有机溶剂混合，在变性剂和保护剂的作用下，在140‑160℃下反应的时间为24‑48h，制备获得复合分子筛树脂，再加入酸性溶液抽滤洗涤至中性，干燥后获得正电荷分子筛；将待纯化的蛋白样品经步骤1)获得的正电荷分子筛过滤，获得的滤液经尺寸排阻色谱层析对蛋白进行纯化，或者将获得的滤液经阴离子交换层析对蛋白进行纯化，获得纯化溶液。本发明使用于工业化生产目的蛋白。

技术领域

本发明属于蛋白纯化技术领域，具体涉及一种蛋白分离纯化的方法。

背景技术

分子筛层析又称为凝胶过滤层析或体积排阻层析。分子筛层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名为Sephadex，其型号有多种，从G10到G200，其主要应用范围是：①分级分离各种抗原与抗体；②去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；③分析血清中的免疫复合物；④分子量的测定。凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。

离子交换层析(Ion Exchange Chromatography简称为IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。上世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。离子交换层析是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

发明内容

为了能够大剂量纯化出纯度较高的蛋白，本发明提供了一种蛋白分离纯化的方法，包括如下步骤：

1)制备正电荷分子筛：将不带电荷的分子筛树脂与有机溶剂混合，在变性剂和保护剂的作用下，在140-160℃下反应24-48h，制备获得复合分子筛树脂，再加入酸性溶液抽滤洗涤至中性，干燥后获得正电荷分子筛；

2)将待纯化的蛋白样品经步骤1)获得的正电荷分子筛过滤，获得的滤液经尺寸排阻色谱层析对蛋白进行纯化，或者将获得的滤液经阴离子交换层析对蛋白进行纯化，获得纯化溶液。

进一步地限定，步骤1)所述有机溶剂为甲苯、三甲基苯、丙酮、甲醇、乙醇中的一种或多种的混合；所述变性剂为3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷、γ-氨丙基三乙氧基硅烷等氨基烷类中的一种或多种的混合；所述保护剂为氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气中的一种或多种的混合，所述“多种的混合”是指各物质或试剂之间以任意比混合。