[发明专利]一种重组G-17蛋白及其单克隆抗体的制备

说明书

本发明属于生物技术领域。本发明提供了一种重组蛋白，该重组蛋白包含胃泌素‑17(以下称G‑17)全部抗原表位，并将全部抗原表位序列通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后重复十次，形成重组G‑17蛋白氨基酸序列。为提高该重组蛋白在原核表达系统中的产量，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应核苷酸序列，通过化学合成该核苷酸序列并构建重组蛋白表达载体。本发明还涉及该重组蛋白单克隆抗体的制备，经过抗原免疫、细胞融合及多轮筛选后得到单克隆细胞株。纯化的单克隆抗体经过蛋白分子相互作用仪筛选出优势抗体配对，分别标记荧光微球和包被NC膜，通过实验确定最佳单抗配对组合，可用于G‑17的定量检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组蛋白，编码该重组蛋白的核苷酸序列，含有上述核苷酸序列的质粒载体，转化含有上述质粒载体的菌株，还涉及使用上述重组蛋白制备G-17单克隆抗体并筛选G-17单克隆抗体配对，并将配对单抗应用于胃泌素定量检测。

背景技术

我国是胃癌高发国家，胃癌每年新增67.91万例，平均46秒就有一人新患胃癌，居全球首位。胃癌是一种慢性疾病，通常从炎症发展而来。可以通过早期检测发现胃癌前疾病风险，通过及时就诊治疗，避免最终发展至胃癌。

胃泌素是一种主要由胃窦和十二指肠的G细胞分泌的胃肠激素，对调节消化道功能和维持其结构完整有重要作用。人体中，95％以上有生物活性的胃泌素是α-酰胺化胃泌素，主要含两种异构体G-17和G-34，其中80％～90％是G-17。 G-17仅由胃窦部G细胞分泌，因此G-17是反映胃黏膜损伤情况的重要指标，其与胆囊收缩素受体(cholecystokininreceptor,CCKR)结合后通过一系列信号转导而发挥生物学效应，主要参与刺激胃酸分泌及营养胃肠道黏膜，近年研究表明G-17还有促进细胞增殖和抑制凋亡的作用。G-17可以提示患者胃黏膜的功能状态，与反映胃底胃体部萎缩的胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II及其比值已被科技部列为早期胃癌筛查项目之一，因此G-17在胃肠疾病的诊断中具有重要意义。

G-17与胃酸存在严格的负反馈机制。当G-17低值时，通常提示胃部存在高酸的状况；G-17高值时，提示存在胃部炎症，患者具有高胃泌素血症的症状，可能与幽门螺旋杆菌感染、胃溃疡或者药物影响、患者饮食刺激、其它疾病影响相关。

目前检测G-17的成品试剂盒仅采用ELISA方法(BIOHIT公司)，ELISA 能检出极低浓度的G-17(pg级)，但试验流程繁琐且消耗时间长；免疫层析法由于其操作极为简单，且结果不受脂血症和溶血的影响，适合临床应用，例如通过荧光微球平台检测G-17。该方法特异性及灵敏度俱佳，一般能在15～20 分钟内获得准确结果，适合大批量样本快速检测，无特殊人员要求。该方法通常需要制备可识别G-17的单克隆抗体，常规G-17单克隆抗体制备所使用的免疫原是基因工程技术表达的完整蛋白，由于碱基密码子的缘故，该蛋白在大肠杆菌中表达困难、表达量极低，导致后续纯化工作难以开展，严重阻碍其单克隆抗体制备。另外，由于抗原表位氨基酸序列短，仅含17个氨基酸(Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu GluGlu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe)，使用G-17全长多肽作为免疫原，分子量太小难以制备得到单克隆抗体。

发明内容

设计目的：为解决免疫学方法检测G-17的不足之处，通过设计、合成重组 G-17蛋白并制备其单克隆抗体，从而实现对G-17的特异性检测识别，既增强了检测灵敏度，又不会导致检测结果失真。