[发明专利]基于肽段C末端化学衍生提高质谱碎裂效率和响应的方法

说明书

本发明涉及一种基于肽段C末端化学衍生提高质谱碎裂效率和响应的方法。所述的方法包括三步反应，首先将肽段C末端的羧基，或肽段C末端的羧基和侧链谷氨酸或天冬氨酸的羧基进行封闭；接着利用肽段酰胺酶特异性水解并暴露肽段C末端的羧基；最后将暴露的C末端羧基进行碱性分子的化学衍生。肽段C末端标记上的碱性分子能够增加二级质谱中y离子的数目，提高肽段在质谱中的碎裂效率和响应，从而应用于提高多肽类药物肽的检测灵敏度。

技术领域

本发明涉及一种基于肽段C末端化学衍生提高质谱碎裂效率和响应的方法及其应用。

背景技术

多肽类药物是指通过化学合成、基因重组或动植物中提取的具有特定治疗作用的多肽。多肽类药物能够广泛作用于内分泌系统、免疫系统、消化系统、心血管系统、肌肉骨骼系统等。多肽类药物市场增长极快，是近年药物市场研发的趋势之一。目前全球批准上市的多肽药物已超过80余种，如治疗糖尿病的胰岛素、治疗老年疾病和侏儒症的人生长激素、治疗心血管疾病的利钠激素等。多肽类药物活性很高，给药剂量低，体内循环的药物浓度通常在亚纳克每毫升的浓度范围内。生物体内存在大量的干扰物质，如结构相同或者相似的内源性蛋白多肽类物质等，因此多肽类药物的研究需要超高灵敏度的检测方法。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术集高效液相色谱的高分离性能与质谱的高灵敏度于一体，已经广泛应用于多肽类药物的药物代谢与药物动力学研究，并将成为未来发展的趋势。由于很多药物肽的末端缺乏碱性氨基酸导致其在质谱中的碎裂效率差，不利于质谱鉴定。通过在肽段的末端标记碱性分子可以提高多肽类药物的电离效率和离子传输率，从而提高其检测灵敏度。基于肽段C末端的衍生可屏蔽羧基的电负性，从而增强肽段的质谱分析能力。乔晓强等人将阳离子衍生化试剂溴化1-丁基,3-(3-氨丙基)咪唑应用于肽段的羧基衍生化,模式肽段的质谱检测灵敏度可提高42倍以上(Sci China Life Sci,2013,43,96-102)。因此，基于肽段C末端化学衍生碱性分子可以提高多肽类药物在质谱碎裂效率和响应，从而提高其检测灵敏度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于肽段C末端化学衍生提高质谱碎裂效率和响应的方法。为实现该目的，本方法采用的技术方案为：

基于肽段C末端化学衍生提高质谱碎裂效率和响应的方法，首先在含有机相的溶剂中，将肽段C末端的羧基，或肽段C末端的羧基与侧链谷氨酸或天冬氨酸的羧基进行酰胺化反应或者酯化反应；接着利用肽段酰胺酶特异性水解并暴露肽段C末端的羧基；最后在含有机相的溶剂中，将暴露的C末端羧基进行碱性分子的化学衍生，进行质谱检测。

所述的含有机相的溶剂是水和有机相的混合物，溶剂中水的体积浓度2-30％；有机相为乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、异丙醇中的一种或两种以上。

所述的酰胺化反应是指肽段C末端的羧基，或肽段C末端的羧基与侧链谷氨酸或天冬氨酸的羧基与甲胺、乙胺、丙胺、乙醇胺中的一种或两种以上反应生成酰胺类物质；所述的酯化反应是指肽段C末端的羧基，或肽段C末端的羧基与侧链谷氨酸或天冬氨酸的羧基与甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或两种以上反应生成酯类物质。

所述的酰胺化反应温度为4-50℃，反应时间为0.5-12h；所述的酯化反应温度为4-50℃，反应时间为0.5-12h。

所述的肽段酰胺酶从大肠杆菌体内提取，能够特异性催化水解肽段C末端的酰胺键，而对肽段侧链的酰胺键和骨架的肽键无水解作用。

所述的肽段酰胺酶催化水解反应的pH为6.8-8.5，温度为25-50℃，时间为6-48h，酰胺酶与肽段的质量比为1:50-20:1。

所述的碱性分子是氨基胍、胍基丁胺、N,N-二甲基乙二胺、N,N-二甲基-1,3-丙二胺、(2-氨基乙基)三甲基氯化铵中的一种或两种以上。

所述的暴露出C末端羧基的肽段与碱性分子反应时的质量体积比为0.005-1克每毫升，反应温度为4-50℃，反应时间为0.5-12h。