[发明专利]一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法

权利要求书

1.一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法，其特征包括如下步骤：

（1）收集副溶血弧菌活菌体0.6~0.8g，用6~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，离心后收集上清液，得到模板；

（2）将该模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R共同混合后，进行PCR扩增，该PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.3~0.4mmol/L的dNTP、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetA-F、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetA-R、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetB-F、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetB-R、终浓度为0.5~0.6mmol/L的TetD-F、终浓度为0.5~0.6mmol/L的TetD-R和终浓度为0.05~0.08U/uL的TaqDNA聚合酶，其中TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R分别如SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5和SEQ ID 6，上述PCR缓冲液的10倍母液中包括30~40mM氯化钠、pH8.3的15mMTris-HCl、0.01~0.02%甘油和0.05~0.08%硫酸铵，30~40mM MgCl₂；

（3）步骤（2）的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并送交测序。

2.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法，其特征在于：所述步骤（1）为：收集副溶血弧菌活菌体0.6~0.8g，用6~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，10000~12000rpm离心10~15min后收集上清液，得到模板。

3.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.35mmol/L的dNTP、终浓度为0.35mmol/L的TetA-F、终浓度为0.35mmol/L的TetA-R、终浓度为0.35mmol/L的TetB-F、终浓度为0.35mmol/L的TetB-R、终浓度为0.55mmol/L的TetD-F、终浓度为0.55mmol/L的TetD-R和终浓度为0.06U/uL的TaqDNA聚合酶。

4.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法，其特征在于：所述PCR缓冲液的10倍母液中包括35mM氯化钠、pH8.3的15mMTris-HCl、0.01%甘油和0.06%硫酸铵，35mM MgCl₂。

5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件如下：90~95℃ 预变性8~12min ，然后进入如下循环：94~95 ℃变性50~60s、54~55℃退火1~1.2min、72~74 ℃延伸45~50s，共30~35个循环，循环结束后于72℃延伸8~10min，2~4℃保存。

6.如权利要求5所述的一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件如下：93℃ 预变性10min ，然后进入如下循环：94 ℃变性60s、54℃退火1min、74 ℃延伸45s，共30个循环，循环结束后于72℃延伸10min，4℃保存。

7.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌四环素类药物耐药基因检测方法，其特征在于：所述步骤（3）的电泳条件为：2%琼脂糖凝胶，80V电压，时间40min。