[发明专利]一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法

说明书

本发明公开了一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法，该方法包括如下步骤：（1）收集副溶血弧菌活菌体0.6~0.8g，用6~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，离心后收集上清液，得到模板；（2）将该模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA‑F、TetA‑R、TetB‑F、TetB‑R、TetD‑F和TetD‑R共同混合后，进行PCR扩增；（3）步骤（2）的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并测序。本发明的检测方法敏感、特异、快速，可以检测极微量的目的基因，而不需要费时的副溶血弧菌培养。

技术领域

本发明属于涉及一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法。

技术背景

四环素类抗生素包括金霉素、土霉素及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等。四环素类抗生素为广谱抑菌剂，对革兰阳性菌、革兰阴性菌以及厌氧菌，多数立克次体属、支原体属、衣原体属、非典型分枝杆菌属、螺旋体敏感。

国内外研究表明，由于四环素药物长期和大量使用，副溶血弧菌对四环素类药物的耐药性十分严重，对人体健康构成威胁。已经发现的四环素耐药基因有：TetA, TetB,TetC, TetD, TetE, TetG等。

目前我国传统四环素药耐药性检测是通过测定副溶血弧菌最低抑菌浓度或抑菌圈大小测定副溶血弧菌的耐药性，必须经过繁琐的副溶血弧菌分离纯化、繁殖扩增等步骤，检测周期长，最快也要48h左右。不利于及时的选药治疗。由于药敏试验是在体外用药物试探性的检验副溶血弧菌的表型耐药特性，不能检测副溶血弧菌的隐型耐药性。

发明内容

本发明提供一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法。

本发明的具体技术方案如下：

（1）收集副溶血弧菌活菌体0.6~0.8g，用6~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，10000~12000rpm离心10~15min后收集上清液，得到模板。

（2）将该模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R共同混合后，进行PCR扩增，该PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.3~0.4mmol/L的dNTP、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetA-F、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetA-R、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetB-F、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetB-R、终浓度为0.5~0.6mmol/L的TetD-F、终浓度为0.5~0.6mmol/L的TetD-R和终浓度为0.05~0.08U/uL的TaqDNA聚合酶，其中TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R分别如SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5和SEQ ID 6，上述PCR缓冲液的10倍母液中包括30~40mM氯化钠、pH8.3的15mMTris-HCl、0.01~0.02%甘油和0.05~0.08%硫酸铵，30~40mM MgCl₂；

（3）步骤（2）的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并测序。

在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.35mmol/L的dNTP、终浓度为0.35mmol/L的TetA-F、终浓度为0.35mmol/L的TetA-R、终浓度为0.35mmol/L的TetB-F、终浓度为0.35mmol/L的TetB-R、终浓度为0.55mmol/L的TetD-F、终浓度为0.55mmol/L的TetD-R和终浓度为0.06U/uL的TaqDNA聚合酶。