[发明专利]一种改进的PB转座子系统及其用途

说明书

本发明涉及改进的PB转座子系统及其用途。具体而言，本发明提供一种核酸构建体，其依次含有控制PiggyBac转座酶表达的启动子、PiggyBac转座酶编码序列、PiggyBac转座子5’末端重复序列、任选的polyA加尾信号序列1、多克隆插入位点、polyA加尾信号序列2和PiggyBac转座子3’末端重复序列。使用本发明的核酸构建体构建的重组载体具有明显提高的整合效率。

技术领域

本发明涉及一种改进的PB转座子系统及其用途。

背景技术

外源基因在宿主细胞内的表达形式可分为瞬时表达与稳定表达，其中稳定表达是指：(1)外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。重组基因的稳定表达水平一般要比短暂表达低1～2个数量级。(2)宿主细胞虽经过多次传代或条件变化，但表达水平仍然保持稳定。

鉴于稳定表达能随着细胞分裂维持外源基因长时间持续表达，在离体细胞修饰(ex vivo)，如转基因嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen ReceptorT-CellImmunotherapy，CAR-T)治疗研究中具有重要意义。CAR-T细胞能特异识别并高效杀伤表达特定细胞表面抗原的肿瘤细胞，已取得显著的临床疗效。如针对CD19的CAR-T能高效杀伤表达CD19表面抗原的B细胞淋巴瘤，对晚期难治性B细胞淋巴瘤患者，有效缓解率达到90％(Maude SL,Frey N,Shaw PA,Aplenc R,Barrett DM,Bunin NJ,Chew A,Gonzalez VE,ZhengZ,Lacey SF,Mahnke YD,Melenhorst JJ,Rheingold SR,Shen A,Teachey DT,LevineBL,June CH,Porter DL,Grupp SA.，Chimeric antigen receptor T cells forsustained remissions in leukemia，N Engl J Med.2014；371(16):1507-17)。

为实现外源基因在宿主细胞内的稳定表达，常用的载体系统包括：1.逆转录病毒系统：能有效感染宿主细胞，并介导外源基因表达框的基因组高效整合，但其装载容量有限，且重组病毒颗粒制备工艺复杂。2.真核表达质粒系统：制备工艺相对简单，但其通过随机DNA重组的方式插入宿主基因组，整合效率极低。3.转座子系统：采用质粒系统，制备工艺相对简单，通过转座酶将外源基因整合入基因组，整合效率相对较低。

最早应用的哺乳动物转座子系统是源于鱼类的“睡美人”转座子(SleepingBeauty)，但是“睡美人”转座子存在过量抑制效应和携带片段偏小(5kb左右)等缺陷，使其在转基因应用上受到限制。来源于鳞翅目昆虫的piggyBac(PB)转座子是目前哺乳动物中活性最高的转座子。其宿主范围极其广泛，从单细胞生物到哺乳动物都能够发挥作用；能够携带较大的外源DNA片段，当转座片段在14kb以内时，转座效率不会显著下降。PB转座子主要采取“cut-paste”机制发生转座，在转座片段被切除后不会在原位点留下印迹(footprint)，基因组可以实现切除后精确修复，在可逆转基因的应用中具有重要作用。此外，PB转座酶可塑性高，通过与其它功能蛋白融合或改变转座酶的功能区域，不仅能够改变转座酶的活性和作用方式，也可以提高外源基因转座的靶向性。近年来，通过密码子优化、特定位点氨基酸定点突变、相应核定位标签的引入等，使PB在哺乳动物细胞内的整合效率进一步提高，使得该系统在基因组研究、基因治疗、细胞治疗、干细胞诱导和诱导后分化等领域获得了广泛的应用。