[发明专利]人工合成的polyA、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞、表达方法及应用

说明书

本发明涉及一种人工合成的polyA、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞、表达方法及应用，属于生物技术领域。本发明polyA可用于哺乳动物细胞重组表达载体，polyA可以通过控制mRNA的稳定性，提高mRNA的翻译效率来增强哺乳动物或者其他来源蛋白质的分泌表达，能有效提高哺乳动物细胞中蛋白质的产量并降低生产成本。

技术领域

本发明涉及一种人工合成的polyA、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞、表达方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

重组蛋白在细菌、真核微生物、昆虫细胞等宿主中的表达虽然能获得较高的产量，但是这些表达系统缺少类似于哺乳动物细胞的翻译后蛋白质修饰机制的功能，例如准确的N型糖基化和O型糖基化等，这会导致表达的蛋白缺少生物活性或因折叠错误而产生包涵体。与其他系统相比，哺乳动物表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化等多种翻译后加工功能，正因为这些优势的存在使得表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面非常接近于天然的高等生物蛋白质分子。

外源蛋白质在哺乳动物细胞中的表达受很多因素的影响，如表达载体的调控元件、转录和翻译控制因子、转基因拷贝数、mRNA的稳定性、外源基因在染色体上的整合位点、重组蛋白对宿主细胞的潜在毒性和宿主细胞的基因组偏好性等。多聚腺苷酸，即polyA，普遍存在形式是mRNA的polyA尾。几乎所有真核mRNA的加工过程中，mRNA的3'末端都有polyA尾，参与许多mRNA代谢过程。另外mRNA的3'端的polyA尾能够调控mRNA的稳定性，提高mRNA的翻译效率，在成熟mRNA从细胞核向细胞质转运过程中起着重要作用。此外， polyA能保护mRNA，免受核酸外切酶攻击，并且影响转录终止、蛋白质翻译。

目前，对提高哺乳动物细胞的表达载体的优化主要集中在启动子、增强子、核基质附着区等，而polyA元件对哺乳动物细胞转基因表达的影响并未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工合成的polyA，该人工合成的polyA可以增强 mRNA的稳定性，进而提高哺乳动物宿主细胞中外源蛋白的表达。

本发明还提供一种哺乳动物细胞重组表达载体，该哺乳动物细胞重组表达载体含上述人工合成的polyA，可以提高外源蛋白质在哺乳动物细胞中的表达量。

另外，本发明提供一种哺乳动物宿主细胞，该哺乳动物宿主细胞含上述哺乳动物表达载体，可以改善哺乳动物细胞外源蛋白表达量低的问题。

此外，本发明还提供一种哺乳动物细胞表达外源蛋白质的表达方法，通过该方法获得的目的蛋白表达水平高，生产成本低。

本发明还提供上述人工合成的polyA、哺乳动物细胞重组表达载体、或者哺乳动物宿主细胞在提高哺乳动物细胞重组蛋白表达水平中的应用。该应用可以提高mRNA的翻译效率，增强动物细胞中mRNA的稳定性，提高外源蛋白的表达。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种人工合成的polyA，所述人工合成的polyA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该核苷酸序列可以成倍提高外源蛋白在哺乳动物细胞的表达量。

一种哺乳动物细胞重组表达载体，包含哺乳动物来源的蛋白质序列，所述哺乳动物细胞重组表达载体还含有如SEQ ID NO.1所示的人工合成的polyA的核苷酸序列。该哺乳动物细胞重组表达载体可以使EGFP基因表达量提高1倍多，使阿达木抗体表达量提高1～2倍，进而降低了哺乳动物细胞生产重组蛋白的成本。

所述哺乳动物细胞重组表达载体中的启动子为CMV、SV40、EF-1α、CAG 中的任意一种。上述启动子为哺乳动物细胞重组表达载体常用的启动子，适用于哺乳动物细胞重组表达载体中。

所述启动子为CMV启动子。CMV启动子是哺乳动物细胞重组表达载体中最常用的且表达量比较高的启动子。