[发明专利]一种麦芽糖淀粉酶突变体的制备及其应用

说明书

本发明公开了一种麦芽糖淀粉酶突变体的制备及其应用，属于酶工程领域。本发明构建的麦芽糖淀粉酶突变体在20U/g干淀粉的添加量下，二次糖化过程中可使麦芽糖含量在转化反应进行10h时提高至97％以上，三糖、四糖含量在反应5h时趋近于0。与野生型麦芽糖淀粉酶相比，具有更高的转化效率以及更少的转化副产物，具有重要的工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种麦芽糖淀粉酶突变体的制备及其应用，属于酶工程领域。

背景技术

麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase或maltogenase，EC 3.2.1.133)是糖苷水解酶GH-H系成员。目前，麦芽糖淀粉酶主要的细菌来源为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热放线菌(Thermus vulgaris)以及栖热菌属(Thermus sp.)等。不同来源的麦芽糖淀粉酶，在性质上也有很大的区别。目前应用于麦芽糖浆制备和抗面包老化的麦芽糖淀粉酶，主要来源于嗜热脂肪芽孢杆菌。

麦芽糖是由两个葡萄糖单位经α-1，4糖苷键连接组成的还原性二糖，化学名称是4-O-D-六环葡萄糖基-D-六环葡萄糖。其甜度柔和，又因低粘度、低吸湿性及良好的热稳定性特点，可作为食品增甜剂取代葡萄糖和蔗糖，在食品工业领域具有巨大的应用潜力。工业上麦芽糖的制备，是以淀粉质为原料，经过α-淀粉酶，麦芽(或β-淀粉酶，真菌淀粉酶)水解工艺，制得一种以麦芽糖为主(40％-60％)的糖浆，若麦芽糖含量超过45％(最好在50％以上)，则被称为高麦芽糖浆。在食品工业中高麦芽糖浆的用途之一是制作糕点、糖果等产品。糖浆熬煮温度远高于饴糖，一般超过140℃。麦芽糖含量大于70％，甚至高达90％以上，则被称为超高麦芽糖浆。麦芽糖相比葡萄糖可避免血糖升高，对于应用于抗体、疫苗等的制备具有优于葡萄糖的应用优势。因此超高纯度的麦芽糖浆在医药领域的应用也引起了越来越多的关注。

当前麦芽糖生产工艺已较为成熟，使用α-淀粉酶和β-淀粉酶生产麦芽糖时，产物中麦芽糖含量可高达90％，葡萄糖、三糖、四糖以及部分低聚糖和糊精是主要的转化副产物。其中糊精和部分低聚糖，可通过乙醇沉淀去除。超高纯度麦芽糖的制备，则要通过色谱分离和结晶等方法获得。由于麦芽糖黏度大、难结晶，通常要求结晶原料中麦芽糖纯度在90％以上，因此色谱分离的纯度，对麦芽糖结晶起着至关重要的作用。色谱分离基本可去除葡萄糖和五糖及以上的小分子糖类，对麦芽糖纯度影响较小。但产物中的三糖和四糖由于与麦芽糖性质较为相近，往往成为分离纯化中的主要杂质，不仅直接降低了产品纯度，还给麦芽糖结晶性、糖浆粘度以及最终产品的水分含量带来很大不利影响，使麦芽糖最终收率大大降低。

麦芽糖淀粉酶具有小分子糖水解活性，可水解三糖、四糖等小分子糖，形成葡萄糖和麦芽糖，因此在超高麦芽糖生产中通常与α-淀粉酶、β-淀粉酶和普鲁兰酶等复配使用以降低副产物比例，使麦芽糖更利于结晶。据报道，来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的麦芽糖淀粉酶具有较高的最适反应温度和较低的最适pH反应条件，可满足较为苛刻的工业生产条件，将产物中麦芽糖比例提高至92％，在工业上有极大的应用优势。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种麦芽糖淀粉酶的突变体，含有SEQ ID NO.1～8任一所示的序列。

本发明的第二个目的是提供一种提高麦芽糖淀粉酶转化效率的方法，所述方法是将NCBI登录号：AAA22233.1的麦芽糖淀粉酶为出发序列，分别对第198位和/或290位氨基酸进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将第198位的赖氨酸(Lys)分别突变成谷氨酸(Glu)和酪氨酸(Tyr)，标记为K198E，K198Y。