[发明专利]具有基因编辑功能的膜性囊泡及其制备方法、药物组合物和用途

权利要求书

1.通过细胞外泌获得的膜性囊泡在制备用于递送CRISPR/Cas9系统进而实现对靶细胞基因编辑的药物递送系统中的用途，其特征在于，所述膜性囊泡包括生物相容性外壳和由所述生物相容性外壳包裹的内部基质，其中，所述生物相容性外壳具有脂质双层结构，其能够与靶细胞表面接触并使至少所述内部基质进入所述靶细胞内；所述内部基质包含导向RNA即gRNA，和Cas9蛋白，但不包含用于表达gRNA和/或编码Cas9蛋白的基因，所述gRNA的至少部分序列能够与靶DNA互补，且所述gRNA能够与所述Cas9蛋白形成功能性复合体；

所述膜性囊泡通过包括下述步骤的方法制备得到：

(1) 在适于细胞生长的条件下培养具有外泌功能的工程细胞使得gRNA和Cas9蛋白进入外泌体的步骤；

(2) 从所述工程细胞的培养液中分离外泌体的步骤；

其中，步骤(1)中的所述工程细胞选自Vero细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HuH7细胞、HEK-293细胞和巨噬细胞中的至少一种，且包含产生gRNA和编码具有活性的Cas9蛋白的基因。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述膜性囊泡的制备方法进一步包括将用于表达gRNA和/或编码Cas9蛋白的基因导入细胞得到所述工程细胞的步骤。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述膜性囊泡的直径为30-1000nm，密度为1.13-1.28g/m1。

4.通过细胞外泌获得的膜性囊泡用于制备药物的用途，其特征在于，所述膜性囊泡包括生物相容性外壳和由所述生物相容性外壳包裹的内部基质，其中，所述生物相容性外壳具有脂质双层结构，其能够与靶细胞表面接触并使至少所述内部基质进入所述靶细胞内；所述内部基质包含gRNA和Cas9蛋白，但不包含用于表达gRNA和/或编码Cas9蛋白的基因，所述gRNA的至少部分序列能够与靶DNA互补，且所述gRNA能够与所述Cas9蛋白形成功能性复合体；

所述膜性囊泡通过包括下述步骤的方法制备得到：

(1) 在适于细胞生长的条件下培养具有外泌功能的工程细胞使得gRNA和Cas9蛋白进入外泌体的步骤；

(2) 从所述工程细胞的培养液中分离外泌体的步骤；

其中，步骤(1)中的所述工程细胞选自Vero细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HuH7细胞、HEK-293细胞和巨噬细胞中的至少一种，且包含产生gRNA和编码具有活性的Cas9蛋白的基因。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述膜性囊泡的制备方法进一步包括将用于表达gRNA和/或编码Cas9蛋白的基因导入细胞得到所述工程细胞的步骤。

6.一种用于在细胞内进行基因编辑的非治疗方法，其包括使用通过细胞外泌获得的膜性囊泡递送CRISPR/Cas9系统进而实现对靶细胞基因编辑的步骤，其中，所述膜性囊泡包括生物相容性外壳和由所述生物相容性外壳包裹的内部基质，其中，所述生物相容性外壳具有脂质双层结构，其能够与靶细胞表面接触并使至少所述内部基质进入所述靶细胞内；所述内部基质包含gRNA和Cas9蛋白，但不包含用于表达gRNA和/或编码Cas9蛋白的基因，所述gRNA的至少部分序列能够与靶DNA互补，且所述gRNA能够与所述Cas9蛋白形成功能性复合体；

所述膜性囊泡通过包括下述步骤的方法制备得到：

(1) 在适于细胞生长的条件下培养具有外泌功能的工程细胞使得gRNA和Cas9蛋白进入外泌体的步骤；

(2) 从所述工程细胞的培养液中分离外泌体的步骤；

其中，步骤(1)中的所述工程细胞选自Vero细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HuH7细胞、HEK-293细胞和巨噬细胞中的至少一种，且包含产生gRNA和编码具有活性的Cas9蛋白的基因。

7.根据权利要求6所述的用于在细胞内进行基因编辑的非治疗方法，其特征在于，所述膜性囊泡的制备方法进一步包括将用于表达gRNA和/或编码Cas9蛋白的基因导入细胞得到所述工程细胞的步骤。