[发明专利]具有基因编辑功能的膜性囊泡及其制备方法、药物组合物和用途

说明书

本发明公开具有基因编辑功能的膜性囊泡及其制备方法、药物组合物和用途，膜性囊泡包括生物相容性外壳和由生物相容性外壳包裹的内部基质，其中，生物相容性外壳具有脂质双层结构，其能够与靶细胞表面接触，内部基质包含gRNA和Cas蛋白，gRNA的至少部分序列能够与靶DNA互补，且gRNA能够与Cas蛋白形成功能性复合体。

技术领域

本发明涉及药物递送，具体涉及具有基因编辑功能的膜性囊泡、其制备方法和用途。

背景技术

CRISPR/Cas系统是应用较广的基因编辑技术。该技术源于细菌和古生菌中的一种对付噬菌体等外来DNA的防御系统。在某些细菌和古生菌基因组中存在一系列成簇排列的DNA序列，被称作“规律间隔成簇短回文重复序列”(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats，CRISPR)。经序列比对发现，这些重复序列的间隔序列与许多噬菌体DNA序列相同。此外，这些序列转录的RNA能够与细菌和古生菌产生的一类称为Cas(CRISPR associated)的蛋白质形成复合体，当复合体检测到入侵的DNA和RNA序列一致时，这段RNA通过碱基互补的方式与DNA序列结合，引导Cas蛋白识别原型间隔序列毗邻基序(Protospacer Associated Motif,PAM)，Cas蛋白由此到达PAM识别序列的特定位点，实现其对外来DNA的基因编辑，因此这段RNA被称为导向RNA(guide RNA，gRNA)。严格来说，gRNA由两部分组成：一部分为来自于间隔区、识别入侵DNA的crRNA(CRISPR RNA,crRNA),另一部分为活化Cas蛋白所需的tracrRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)。

目前已发现三种不同类型的CRISPR/Cas系统，其中第二型的组成较为简单，以Cas9蛋白和gRNA为核心组成。在实际应用中，将gRNA序列以及编码Cas9蛋白的基因序列装入一个表达载体中。转入宿主细胞后，表达产生的gRNA就能指导Cas9蛋白切割宿主细胞的特定基因序列，从而高效发挥其基因编辑作用。随着金黄色葡萄球菌Cas9的发现，使得CRISPR/Cas9系统可以装入腺相关病毒载体中，致使该技术应用于临床的距离逐渐缩短。然而，由于部分人群对腺相关病毒具有潜在的抵抗性，及其潜在致瘤性等安全隐患，仍需开发更加高效、安全的递送系统。最近，有学者发现通过电穿孔方法将CRISPR/Cas9表达质粒注入外泌体中，可有效递送CRISPR/Cas9系统，进而实现对靶细胞的基因编辑。这一发现揭示了外泌体在递送CRIPSR/Cas9系统中的潜在价值。然而，通过外泌体传递CRISPR/Cas9表达质粒，一方面由于质粒表达的大量gRNA和Cas9蛋白使得发生脱靶效应的风险较大；另一方面由于质粒DNA有可能整合至靶细胞基因组，使其具有潜在致癌性的安全问题。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明进行了深入研究，发现细胞内源产生的膜性囊泡可直接包裹CRISPR/Cas9系统中的gRNA和Cas9蛋白，并可将gRNA和Cas9蛋白传递至其它细胞行使其基因编辑功能。由于gRNA和Cas9蛋白在细胞内会很快降解，所以直接传递gRNA和Cas9蛋白可以大大降低二者持续表达所带来的脱靶效应的发生风险。至少部分地基于上述研究完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种具有基因编辑功能的膜性囊泡，其包括生物相容性外壳和由所述生物相容性外壳包裹的内部基质，其中：

所述生物相容性外壳具有脂质双层结构，其能够与靶细胞表面接触并使至少所述内部基质进入靶细胞内；

所述内部基质包含gRNA和Cas蛋白，所述gRNA的至少部分序列能够与靶DNA互补，且所述gRNA能够与所述Cas蛋白形成功能性复合体。

在某些实施方案中，所述内部基质不包含用于表达gRNA和/或编码Cas蛋白的基因。