[发明专利]一种用于检测CPV核酸的试剂盒、RPA引物对、探针及方法

说明书

本发明公开了一种用于检测CPV核酸的试剂盒、RPA引物对、探针及方法。所述的试剂盒包括RPA反应体系，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针如5’SEQ ID NO.3+FAM‑dt+THF+BHQ1‑dt+SEQ ID NO.4+C3Spacer 3’所示。利用本发明的试剂盒进行犬细小病毒的检测，反应时间短、检测速度快，且灵敏度和特异性高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测CPV核酸的试剂盒、RPA引物对、探针及方法。

背景技术

犬细小病毒病是犬的一种急性传染病，由犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起，临床上以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征。CPV主要通过直接或间接接触感染，多发于3-6月幼龄犬，感染率可高达100％，致死率为10-50％。该病的流行无明显季节性，感染犬是本病的主要传染源，犬群一旦发病，极难彻底清除，除犬外，猫、狼、狐、浣熊也可自然感染。CPV随粪便、尿液、呕吐物及唾液排除体外，康复犬粪便中可长期带毒。除病毒分离、血凝抑制、电镜检查、ELISA等方法外，PCR是检测CPV核酸最常用的方法，此外还有胶体金、实时荧光PCR、环等温扩增技术(LAMP)等多种新型检测方法。

随着分子生物学的发展，国内外已经建立了检测CPV核酸的常规RT-PCR、realtime RT-PCR和巢式RT-PCR等多种分子生物学方法。常规RT-PCR方法具有高度的特异性和灵敏度、操作过程较为简单，并且其生物安全性较高，散毒危险小，不需要对病原进行分离培养，广泛运用于CPV的检测。real-time RT-PCR比常规PCR的检测更加快速和敏感，并且该检测在封闭体系中进行，不需进行电泳试验，避免了因电泳引起的交叉污染而造成假阳性，同时，也减少了EB的污染。巢式PCR方法涉及两次对PCR的扩増。先用外引物对其DNA模板进行特异性扩増，扩増产物为第二次扩増的模板，再进行内引物的PCR扩増。两次连续特异性扩増降低了因为靶位点过多而发生错配出现的非特异性扩增的可能，因此在灵敏度及特异化上，都较常规的PCR高，检测结果具有更好的准确性。然而，上述方法或需要昂贵的仪器设备，或需要技术娴熟的技术人员，或需要设计复杂的引物和探针，或反应试剂需要冷链运输和保存，不适合普通实验室的推广应用。2006年，一种新等温基因扩增技术——重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)被发明。该技术可在37～42℃条件下、10～30min内等温体外大量扩增目的基因片段。随后，英国TwistDx公司开发出了RPA商品化试剂盒，加快了RPA技术的研发、推广和应用。与聚合酶链式反应(PCR)相比，PRA具有扩增速度快、反应温度恒定、所需仪器简单等优点，特别适用于DNA或RNA的快速检测。目前，RPA已经在病毒、衣原体、支原体、细菌、寄生虫等病原检测方面得到了开发与应用。该技术通过利用重组酶结合引物形成蛋白-DNA混合物，启动寻找模板DNA上的同源序列；当同源序列定位后，则会引发链置换反应。引物结合到对应模板上，聚合酶进而从引物3’末端开始启动DNA合成，实现了在常温下两条引物对靶基因的几何级数扩增。同时，在RPA反应体系中，对引物碱基突变具有较强的耐受性，在引物个别碱基突变后，RPA反应依然可以顺利进行。

重组酶聚合酶扩增是一种新型的、可以替代PCR的核酸检测技术，它能够在20分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合野外及检疫现场使用。为了提高口岸对进出境野生及家养犬猫科动物CPV感染情况的监测和流行病学调查，本研究建立了实时荧光RPA检测CPV的方法，并对方法的特异性、敏感性和稳定性进行了验证。

发明内容