[发明专利]一种植物基因组定向碱基编辑骨架载体及其应用

权利要求书

1.植物基因组定向碱基编辑骨架载体，其特征在于：包含一个由nCas9-PmCDA1核酸酶-胞嘧啶脱氨酶融合蛋白表达单元和合成向导RNA（sgRNA）转录表达单元两个核心区域构成的核心单元，该核心单元由一个Pol Ⅱ型启动子驱动转录；

所述核心单元从5’到3’方向依次为nCas9 ORF-PmCDA1-Poly A-sgRNA cloningscaffold-T；

所述的nCas9 ORF为酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）核酸酶蛋白D10A突变体编码框；PmCDA1为胞嘧啶脱氨酶编码区功能单元；Poly A为多聚A区域；

所述的nCas9核酸酶蛋白D10A突变体编码框nCas9 ORF所编码的氨基酸序列为Seq IDNo.2中第1位至第1382位氨基酸所示；

所述的PmCDA1 胞嘧啶脱氨酶编码区功能单元从N端到C端依次包含GGGS接头、SH3接头、PmCDA1编码区、NLS信号肽、UGI编码区、SGGS接头、NLS信号肽；

所述PmCDA1 胞嘧啶脱氨酶编码区功能单元所编码的氨基酸序列为Seq ID No.2中第1383位至第1788位氨基酸所示；PmCDA1 胞嘧啶脱氨酶编码区功能单元所编码的核苷酸序列为Seq ID No.1中第6157 bp至第7374 bp所示；

所述的sgRNA cloning scaffold为sgRNA克隆及转录单元，转录如序列GCAGCTGGCTGAGGGTGCAT （Seq ID No.8）所示的sgRNA；且sgRNA cloning scaffold为1～6个，T为终止子；所述sgRNA克隆及转录单元sgRNA cloning scaffold从5’端到3’端依次包含tRNA-Gly编码序列、BsaI-ccdB-BsaI单元、sgRNA骨架编码序列、tRNA-Gly编码序列。

2.如权利要求1所述的植物基因组定向碱基编辑骨架载体，其特征在于：所述sgRNA克隆及转录单元sgRNA cloning scaffold的核苷酸序列为Seq ID No.1中第7432 bp至第8300 bp所示。

3.如权利要求1所述的植物基因组定向碱基编辑骨架载体，其特征在于：符合以下至少一项：

a、nCas9核酸酶蛋白D10A突变体编码框nCas9 ORF所编码的核苷酸序列为Seq ID No.1中第2011 bp至第6156 bp所示；

b、多聚A区域Poly A的核苷酸序列为Seq ID No.1中第7384 bp至第7431 bp所示。

4.如权利要求1所述的植物基因组定向碱基编辑骨架载体，其特征在于：

符合以下至少一项：

a、所述的终止子为水稻HSP终止子HSP T，其核苷酸序列为Seq ID No.1中第8307 bp至第8556 bp所示的核苷酸序列所示；

b、所述的Pol Ⅱ 型启动子为玉米pZmUbi1启动子pZmUbi1，其核苷酸序列为Seq IDNo.1中第1 bp至第2008 bp所示。

5.如权利要求1～4任一项所述的植物基因组定向碱基编辑骨架载体，其特征在于：所述骨架载体的核心单元具有pZmUbi1-nCas9 ORF- PmCDA1-Poly A-sgRNA cloningscaffold-HSP T的结构，核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

6.针对植物基因组目标位点特定胞嘧啶碱基进行定向碱基编辑的重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：

a、明确特定生物基因组目标DNA区域，分析具有PAM特征的区域，选择PAM结构5’端相邻的15～30bpDNA序列作为特异性靶序列；

b、按照选定的特异性靶序列，分别合成具有5’-CGGA-N_X-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AAAC-N_X-3’特征的反向寡核苷酸链，N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且14≤X≤30，其中所述正向寡核苷酸链中的N_X和反向寡核苷酸中的N_X具有反向互补特征；通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；

c、将权利要求1～5任一项所述的植物基因组定向碱基编辑骨架载体与步骤b得到的互补寡核苷酸双链片段混合，反应体系中同时加入BsaI内切酶及T4 DNA连接酶，设置酶切-连接循环反应，得到针对位点的进行定向碱基编辑的重组表达载体。