[发明专利]一种植物基因组定向碱基编辑骨架载体及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种植物基因组定向碱基编辑骨架载体及其应用。本发明要解决的技术问题是提升植物细胞基因组的定向碱基编辑效率、拓展碱基编辑窗口。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种植物基因组定向碱基编辑骨架载体，该骨架载体由一个Pol Ⅱ型启动子驱动nCas9‑PmCDA1核酸酶‑胞嘧啶脱氨酶融合蛋白表达单元和合成向导RNA(sgRNA)转录表达单元两个核心区域构成的核心单元的转录。本发明单一转录单元定向碱基编辑骨架载体，可有效实现胞嘧啶碱基(C)转变为胸腺嘧啶碱基(T)的简单、快捷、高效定向编辑，是一种有效实现植物基因组碱基定向编辑的分子工具。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种植物基因组定向碱基编辑骨架载体及其应用。

背景技术

基因组定向修饰一直是生物学研究的前沿与热点领域，通过对基因组特定区域进行精确定向修饰：一方面可以针对目标序列进行精确突变，获得突变材料，对目标基因功能进行明确鉴定；另一方面可以进行目标序列的精确置换或插入，将外源基因随机导入造成的表达及遗传的不确定性降至最低。

2012年，研究者首次证明了CRISPR-Cas(Clustered regularly interspacedshort palindromic repeats-CRISPR associated protein)可以实现序列特异性DNA双链剪切，随后CRISPR-Cas9系统在包括食蟹猴、斑马鱼、小鼠、人源细胞系、拟南芥、水稻等动植物系统中实现了基于RNA导向的细胞内基因组定向编辑。在该基因组定向编辑体系中，Cas蛋白在向导RNA引导下，识别并剪切特定DNA序列产生DNA双链断裂(double strandbreaks，DSBs)，进而基于细胞内源DNA修复系统实现目标位点DNA序列定向编辑。目前已知的真核生物DNA修复系统可分为两大类：“同源重组”(homologous recombination,HR)修复；“非同源性末端连接”(nonhomologous end joining,NHEJ)修复。HR依据同源序列为模板，精确修复受损DNA区域；而NHEJ则不需要同源序列的存在，直接将DNA损伤形成的断裂末端进行连接，在完成修复的同时往往也引入不同程度的序列变异。

尽管CRISPR-Cas基因组编辑工具可有效实现目标基因组序列定向编辑，但基于NHEJ修复途径的编辑事件主要是在目标修饰位点随机引入碱基插入或缺失突变，而基于HR修复途径的编辑事件尽管可依据供体模板DNA精确进行目标修饰位点序列替换，但其发生频率效率远低于NHEJ修复途径介导的编辑事件，极大限制了CRISPR-Cas基因组编辑工具进行精准碱基编辑相关基础研究及应用实践的有效应用。

为了提高基因组目标位点特定碱基精准编辑效率，有效实现目标位点单碱基精准替换编辑，研究者在CRISPR-Cas基因组编辑工具基础上，通过将特定碱基脱氨酶与dCas9、nCas9或你Cas12a进行融合，实现了针对基因组目标位点特定碱基的精准替换编辑(如：碱基C替换为碱基T；碱基A替换为碱基G)，这种新型基因组编辑工具被称为碱基编辑器(baseeditor,BE)。定向碱基编辑技术，可以针对基因组目标位点特定单碱基进行有效替换编辑，是CRISPR-Cas基因组编辑技术的有益补充，于2017年被《科学》杂志评为全球十大年度科学突破之一，凸显了该技术在基础研究及应用实践中的重要潜力。

基于CRISPR-Cas系统的定向碱基编辑工具，有效扩展了CRISPR-Cas系统的应用范围，显示了其广泛应用前景。但现有定向碱基编辑工具，普遍存在编辑效率偏低、编辑窗口有限的问题，特别是在植物基因组编辑应用实践中，此类问题更为明显，急需研发具备高碱基编辑效率、宽碱基编辑窗口的增强型植物定向碱基编辑工具，以便有效拓展基于CRISPR-Cas系统的定向碱基编辑技术在植物基因组功能研究及育种实践中的积极应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提升植物细胞基因组的定向碱基编辑效率、拓展碱基编辑窗口。