[发明专利]一种条件性诱导表达AsCpf1慢病毒载体及其构建方法和在猪小肠上皮细胞建系中的应用

权利要求书

1.一种条件性诱导表达AsCpf1慢病毒载体的构建方法，其特征在于包括步骤：

1)双酶切pCW-Cas9载体，得到长度为7595bp的线性化Tet-on-3G慢病毒载体片段；

2)利用引物1和引物2，以pLVX-AsCpf1质粒为模板扩增AsCpf1基因，得到长度为4026bp的AsCpf1基因片段，所述引物1和引物2的序列如SEQ ID NO1和2所示；

3)通过连接酶将步骤2)所得AsCpf1基因片段与步骤1)中Tet-on-3G慢病毒载体片段连接，即构建获得长度为11585bp的Tet-on-3G-pLVX-AsCpf1慢病毒载体。

2.根据权利要求1所述的一种条件性诱导表达AsCpf1慢病毒载体的构建方法，其特征在于：步骤1)中所述的双酶切为通过Nhe1和Bamh1进行双酶切。

3.一种如权利要求1或2所述的条件性诱导表达AsCpf1慢病毒载体的构建方法获得的Tet-on-3G-pLVX-AsCpf1慢病毒。

4.如权利要求3所述的Tet-on-3G-pLVX-AsCpf1慢病毒在猪小肠上皮细胞建系中的应用。

5.一种条件性诱导AsCpf1表达的猪小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于包括步骤：

1)通过对Tet-on-3G-pLVX-AsCpf1慢病毒载体进行慢病毒包装，获得Tet-on-3G-pLVX-AsCpf1病毒液；

2)用Tet-on-3G-pLVX-AsCpf1病毒液对猪小肠上皮细胞进行病毒侵染，经嘌呤霉素筛选，获得稳转的条件性诱导表达AsCpf1的猪小肠上皮细胞系；

3)对条件性诱导表达AsCpf1的猪小肠上皮细胞系进行目标基因CrRNA载体的转染，经灭稻瘟菌素筛选，获得CrRNA稳转条件性诱导AsCpf1表达的猪小肠上皮细胞系。