[发明专利]一种条件性诱导表达AsCpf1慢病毒载体及其构建方法和在猪小肠上皮细胞建系中的应用

说明书

本发明公开了一种条件性诱导表达AsCpf1慢病毒载体的构建方法，本发明还公开了用该种慢病毒载体包装所获得的Tet‑on‑3G‑pLVX‑AsCpf1慢病毒及其在猪小肠上皮细胞建系中的应用。猪小肠上皮细胞是研究肠道营养及其免疫等方面应用较广的一种细胞材料，本发明利用Tet‑on‑3G系统调控AsCpf1表达的慢病毒系统筛选出诱导表达的稳转猪小肠上皮细胞系，当添加Dox诱导时，24h内细胞就启动了大量AsCpf1表达，无Dox诱导时无AsCpf1表达；当停止添加Dox时，AsCpf1在12h后显著下降，在停止添加Dox 24h和48h时AsCpf1表达水平极低，72h后观察不到表达。

技术领域

本发明涉及基因生物工程领域，特别涉及一种CRISPR-AsCpf1系统及其在猪小肠上皮细胞建系中的应用。

背景技术

CRISPR/Cas系统最早在古细菌中发现，是古细菌用来抵御外源遗传物质的入侵的一种防御系统。它通过特异性的小RNA指引识别外源DNA序列，并通过表达核酸酶将它们切断，沉默外源基因的表达。正是由于这种精确的基因靶向功能，CRISPR/Cas9系统被开发成一种高效的基因编辑工具。

张锋等(2015)发表在《细胞》杂志上的一项研究中，报道了CRISPR/Cpf1系统。Cpf1隶属于II类Type V CRISPR系统，其具有与Cas9系统不同的优势，可以让基因编辑更简单和精准。CRISPR/Cpf1相比CRISPR/Cas9主要具有如下优势：1)Cpf1酶比标准的SpCas9要小，更容易操作；2)Cpf1剪切时离识别位点很远，位置更灵活；3)Cpf1在目标序列的选择上更加灵活，需要更短的RNA序列引导，并利用富含T的protospacer相邻基序(PAM)序列切割双链DNA(dsDNA)靶标；4)Cas9剪切DNA分子的双链，最后形成的是平末端，而Cpf1剪切后形成相差5nt的黏性末端。张锋评论说：粘性末端让DNA插入更可控。

CRISPR/Cas9系统利用细胞自身DNA修复机制，即同源重组与非同源末端连接可以靶向的转入外源DNA。虽然同源重组的准确性很高，但由于高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组的机率非常低，约为百万分之一，要把外源基因成功敲入细胞是一件非常困难的工作。另有最新研究显示CRISPR/Cas9系统利用环状DNA进行非同源末端连接的机制获得理想的精准靶向外源DNA整合结果，但操作繁琐。更简单，高效和精准的外源DNA整合技术成为目前医学和动植物育种应用的迫切需要技术之一。

Cpf1高敲除低脱靶的切割特性使得其有望成为高效的体外DNA靶向整合工具，Cpf1主要包括FnCpf1、AsCpf1和LbCpf1，其中FnCpf1识别5’-YTN-3’，而AsCpf1和LbCpf1识别5’-TTTN-3’PAM。以猪小肠上皮细胞为研究模型，可望建立条件性诱导表达CRISPR/AsCpf1系统，为后续猪小肠上皮细胞的科学研究和应用提供可靠的细胞材料。

CRISPR基因编辑技术是目前应用最广和最主流的基因研究工具，极大的促进了医学和生命科学的研究发展，但目前在人类医学上应用最大的瓶颈是其脱靶效应引起的极其严重的后果，极大的限制了其在人类医学上应用，更精细精准的调控成为目前研究最亟待解决问题之一。Tet-on系统因具有极为严密的开/关调控的功能，在制作转基因动物和人类医学研究中得到了广泛的应用。该系统实现了对转入的外源基因时间上的调控表达。人为的控制AsCpf1表达，一定程度上减少了CRISPR系统长期表达进而造成不可预估的脱靶效应，具有潜在应用前景。当在细胞和动物体上研究一些基因时，添加诱导剂，基因得到调控，然后及时停止添加诱导剂，关闭CRISPR的系统，防止长时间表达引起脱靶。此外对于凋亡调控基因，通过条件性诱导表达可以避免种子细胞枯竭。CRISPR-AsCpf1系统将被广发应用于建立各种动物和细胞模型上，成为功能基因组学和医学研究的有力工具。将CRISPR-AsCpf1系统与Tet-on诱导表达系统相结合，有望更好地实现CRISPR-AsCpf1对各种模型动物和细胞模型进行基因的时空敲除、敲入及基因修饰作用，真正按照人们意愿及需求建立各种动物模型及探索研究全基因组基因功能分析提供技术支持。