[发明专利]基于化学交联质谱解析的质膜蛋白质相互作用的鉴定方法

权利要求书

1.基于化学交联质谱解析的质膜蛋白质相互作用的鉴定方法，其特征在于：在保持生物样品质膜结构的前提下进行实验，

使用不透过生物样品质膜的化学交联试剂与生物样品的质膜蛋白质发生化学交联反应；

然后对质膜蛋白质进行还原、烷基化和酶解的样品预处理操作，得到肽段样品，进行质谱鉴定和数据检索，获得基于化学交联策略的质膜蛋白质相互作用信息；

所使用的化学交联试剂，含有能使其不通过生物样品质膜的特征基团；所使用的化学交联试剂，含有两个能与氨基酸残基发生化学反应形成共价键的反应活性基团；不通过质膜的化学交联试剂的特征基团为磺酸根、铵根、磷酸根、硫鎓离子中的一种或两种以上；

所述化学交联试剂含有或不含有富集基团，若所述化学交联试剂含有富集基团，则富集基团包括直接富集基团或由间接富集基团引入直接富集基团；

直接富集基团为生物素、金刚烷中的一种；间接富集基团为烯基、炔基、叠氮中的一种；

所述交联反应过程为：用于分散生物样品的溶液为pH范围为6.0到9.0、浓度为 1mM 到200mM 的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，或pH 范围为6.0 到9.0 的1х磷酸盐缓冲液；用于溶解化学交联试剂的有机相溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的一种，溶解后化学交联试剂加入交联反应体系中；发生交联反应的生物样品的浓度为 1 到 1х10¹⁰⁰个/mL；发生交联反应的化学交联试剂的浓度为 0.001 到 50mM；发生交联反应时有机相与水相的体积比为 1：1000 到 10：1；交联反应温度为 0 到 50℃；交联反应时间为 1min 到 48h；所述试剂的浓度均为于交联反应体系中的终浓度；所述交联样品，经过三(2-羧乙基)膦盐酸盐或二硫苏糖醇还原、碘代乙酰胺烷基化及酶解步骤得到肽段样品；生物样品为含有质膜的细胞；

所得到的肽段，若为通过不含有富集功能基团的化学交联试剂反应得到，则应通过强阳离子交换或体积排阻色谱的方式对含有蛋白质相互作用信息的交联肽段进行富集；

所得到的肽段，若为含有富集功能基团的化学交联试剂反应得到，则应通过富集反应，将含有富集功能基团的肽段富集出来。

2.根据权利要求 1 所述的鉴定方法，其特征在于：质膜蛋白质相互作用信息包括质膜蛋白质的空间结构、质膜上蛋白质-蛋白质相互作用关系。

3.根据权利要求 1 所述的鉴定方法，其特征在于：两个能与氨基酸残基发生化学反应形成共价键的反应活性基团，包括氨基反应活性基团，巯基反应活性基团，光反应活性基团中相同的一种或不同的两种；所述氨基反应活性基团为 N-羟基琥珀酰亚胺酯、亚胺酸酯、碳化二亚胺中的一种或两种以上；巯基反应活性基团为马来酰亚胺；光反应活性基团为芳基叠氮、双吖丙啶、二苯甲酮中的一种或者两种以上。

4.根据权利要求1 所述的鉴定方法，其特征在于：所述间接富集基团是通过点击化学反应引入直接富集基团，然后进行富集反应。