[发明专利]一种重组人角质细胞生长因子-1及其制备方法和用途在审
| 申请号： | 201811408920.1 | 申请日： | 2018-11-23 |
| 公开（公告）号： | CN109402130A | 公开（公告）日： | 2019-03-01 |
| 发明（设计）人： | 高坪;张培海 | 申请（专利权）人： | 成都中医药大学附属医院 |
| 主分类号： | C12N15/12 | 分类号： | C12N15/12;C12N15/85;C12N5/10;C07K14/50;C07K1/18;A61K38/18;A61P17/02;A61P11/00;A61P13/10;A61P13/02 |
| 代理公司： | 成都高远知识产权代理事务所(普通合伙) 51222 | 代理人： | 李高峡;张娟 |
| 地址： | 610000 四*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 重组人角质细胞生长因子 角质细胞生长因子 疾病 损伤 中国仓鼠卵巢细胞系 膀胱 肺部损伤 尿道上皮 细胞增殖 重组质粒 黏膜组织 电转 质粒 制备 治疗 皮肤 基因 生产 | ||
1.一种重组人KGF-1的基因片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是pCMV质粒。
4.一种重组质粒，其特征在于：它包含权利要求2和3所述的核苷酸序列和质粒载体，其特征是：所述重组质粒是表达质粒pCMV-KGF-1。
5.一种表达重组人KGF-1基因的重组细胞，其特征在于包含权利要求2和3所述的重组质粒。
6.根据权利4要求所述表达细胞，其特征在于：所述的重组细胞为含重组质粒的中国仓鼠卵巢CHO细胞。
7.一种重组人KGF-1，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
8.一种制备权利要求1或7所述重组人KGF-1的方法，其特征在于：包含如下步骤：
(1)取权利要求5或6所述的重组细胞，接种于商业用无血清添加培养基Acti Pro中悬浮培养，期间流加补料Cell Boost 7a powder supplement两次，培养温度37℃，加料时间为第3天和第5天，第7天于4℃条件下收集培养液，离心，过滤，得上清；
(2)取上清液，用离子交换层析技术分离纯化：先用阴离子交换层析再阳离子交换层析；
阴离子层析时流动相A作为平衡缓冲液，用于冲洗层析系统流速1.5mL/min，检测波长254nm和280nm；用流动相B对其目的蛋白进行梯度洗脱，收集洗脱样品，所述梯度洗脱的方式为：100-50％A、0-50％B，洗脱20min；
阳离子层析时流动相A为：20mM柠檬酸，pH6.0；流动相B为：20mM柠檬酸，含1M氯化钠，pH6.0；流速1.5mL/min，检测波长254nm和280nm；用流动相B对其目的蛋白进行梯度洗脱，收集洗脱样品，即得；所述梯度洗脱的方式为：100-70％A、0-30％B，洗脱20min；
所述流动相A为20mM的Tris-HCl溶液；所述流动相B为1M氯化钠的20mM的Tris-HCl溶液。
9.权利要求7或8所述重组人KGF-1在制备治疗皮肤损伤、黏膜组织损伤、肺部损伤、膀胱上皮损伤或尿道上皮损伤的药物中的用途。
10.一种药物，其特征在于：它是以权利要求7或8所述重组人KGF-1为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
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