[发明专利]一种重组人角质细胞生长因子-1及其制备方法和用途

说明书

本发明涉及一种重组人角质细胞生长因子‑1(KGF‑1)生产方法。还公开了含重组人角质细胞生长因子‑1的基因的重组质粒，该质粒电转染到中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)中后人角质细胞生长因子的表达方法及纯化步骤。本发明人角质细胞生长因子‑1能显著促进4MBr‑5细胞增殖，适合用于治疗因皮肤及黏膜组织损伤相关的疾病、肺部损伤相关疾病以及治疗膀胱或尿道上皮损伤相关的疾病。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及重组人角质细胞生长因子-1(rhKGF-1)及其制备方法和用途。

背景技术

人角质细胞生长因子-1(KGF-1或KGF)，也称为成纤维细胞生长因子-7(FGF-7)，是人肺泡II型上皮细胞增殖、迁移和分化的一种重要的旁分泌辅助因子，通过结合上皮细胞受体KGFR发挥重要功能。在体外培养的支气管上皮细胞中，KGF可加速上皮细胞愈合，增强气道上皮细胞的修复和循环上皮细胞的动员和迁移。KGF促进气道上皮细胞增殖并对活性氧的解毒具有重要意义。在动物模型中，KGF可降低大鼠肺泡损伤和死亡率，也可减少急性肺损伤对气体交换区域的影响。此外，在原代泌尿上皮细胞缺乏KGF培养时细胞分裂将终止；在KGF敲出小鼠中，输尿管芽发生，而且肾集合系统显著小于对照的野生型小鼠；KGF敲出小鼠的膀胱或尿道上皮厚度也比野生型小鼠显著更薄。在环磷酰胺诱导的大鼠溃疡性膀胱炎模型，用重组KGF治疗几乎能完全改善溃疡性症状。这些均提示KGF在治疗肺部损伤相关疾病，以及治疗膀胱或尿道上皮损伤相关的疾病。

重组人KGF(rhKGF)是一种由N末端缺失的KGF突变体或类似物，N末端的缺失已被证明具有增强蛋白质稳定性的作用，在2004年作为治疗性重组蛋白被FDA批准上市(中文名：帕利夫明)，用于治疗因高剂量放化疗所致的严重口腔溃疡。已批准上市的rhKGF是由大肠杆菌表达体系生产制备，该体系流程简单，成本低廉，但从大肠杆菌中提取KGF通常需要经过复性等复杂过程才能得到有活性的可溶性蛋白。而且，大肠杆菌表达体系也存在潜在的安全问题。中国专利申请(201210032424.7和201610458957.X)先后公开了利用昆虫细胞和毕赤酵母作为宿主，重组表达KGF。相对于大肠杆菌，昆虫细胞和毕赤酵母表达体系的优势在于翻译后修饰和无需蛋白复性的产物纯化。但无论是昆虫细胞或是毕赤酵母，经纯化的KGF与天然蛋白间仍然存在活性差异。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组人角质细胞生长因子-1(rhKGF-1)。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

还提供了一种重组载体，它包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。优选地，所述的重组载体是重组pCMV质粒。

还提供了一种重组细胞，它包含前述的重组载体。优选地，所述的重组细胞为重组中国仓鼠卵巢CHO细胞。

本发明提供的重组人角质细胞生长因子-1(rhKGF-1)，它由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种制备前述重组人角质细胞生长因子-1(rhKGF-1)的方法，包含如下步骤：

(1)取前述的重组细胞，接种于商业用无血清添加培养基Acti Pro中悬浮培养，期间流加补料Cell Boost 7a powder supplement两次，培养温度37℃，加料时间为第3天和第5天，第7天于4℃条件下收集培养液，离心，过滤，得上清；

(2)取上清液，用离子交换层析技术分离纯化：先用阴离子交换层析再阳离子交换层析；

阴离子层析时流动相A作为平衡缓冲液，用于冲洗层析系统流速1.5mL/min，检测波长254nm和280nm；用流动相B对其目的蛋白进行梯度洗脱，收集洗脱样品，所述梯度洗脱的方式为：100-50％A、0-50％B，洗脱20min；