[发明专利]诱导脐带间充质干细胞成软骨分化的培养方法，以及该方法所用的培养基

说明书

本发明涉及细胞诱导培养技术领域，具体而言，涉及一种诱导脐带间充质干细胞成软骨分化的培养方法，以及该方法所用的培养基。所述培养基由基础培养基中至少额外添加如下组分得到：TGF‑β3 7～13ng/mL、地塞米松0.07～0.13μmol/L、抗坏血酸酯40～60μg/mL、1×ITS 0.7～1.3w/v％、L‑脯氨酸30～50μg/mL以及丙酮酸钠0.7～1.3mmol/L。本发明通过优化诱导组分，并搭配特定的培养方法，提高了诱导速度，7天后即可形成坚硬密实的软骨，接种的所有间充质干细胞都可分化会软骨细胞，分化率提高。诱导后的软骨小球，质地密实，经特异性染色显示，均充分分化为软骨细胞。

技术领域

本发明涉及细胞诱导培养技术领域，具体而言，涉及一种诱导脐带间充质干细胞成软骨分化的培养方法，以及该方法所用的培养基。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是中胚层来源的、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞。事实上，MSC广泛存在于全身多种组织中，几乎来源于机体所有的组织器官，如骨髓、骨膜、脂肪组织、牙髓、滑膜、脐带、胎盘、羊水及胎儿组织等。不同来源的间充质干细胞具有相似的形态，表达相同的表面标记，具有相似的生物学特性方面，如可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为包括神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞在内的多组织系统的细胞。MSC除了具有多向组织细胞分化能力之外，还在造血、免疫炎症反应、血管新生等人体重要功能中起重要调节作用。

脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞。脐带间充质是一类低免疫原性细胞，且具有很强的免疫调节功能。脐带间充质干细胞拥有MSC的全部特性，并且含量丰富，易于分离培养。

与其他来源的MSC相比，UC-MSC更原始，是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的干细胞，其增殖和分化能力比胚胎干细胞低，但明显高于成体干细胞。

脐带间充质干细胞具有多分化潜能，在特定的诱导条件下，UC-MSC不仅能分化为骨、软骨、脂肪、肌腱等中胚层细胞，而且能够向内胚层组织细胞(如心肌细胞、肝细胞)和外胚层组织细胞(如神经细胞)分化。UC-MSC不具致瘤性，能在不同的诱导条件及合适的体内生长微环境中，安全地定向分化为不同的组织细胞系，具有修复各种组织和器官的能力。

MSCs被诱导分化成软骨细胞是一个受多种因素控制的复杂过程，受多种细胞因子和激素的调控。

转化生长因子β(TGF-β)是发现最早的能够诱发软骨生成的生物活性分子，不但能促进软骨细胞的增殖，还能刺激Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达，提高MSCs分化成软骨的能力。胰岛素在软骨组织工程中也具有十分重要的意义，外源性胰岛素可促进软骨细胞的有丝分裂和细胞外基质的Ⅱ型胶原及GAG合成。

地塞米松(DEX)是一种长效肾上腺糖皮质激素，糖皮质激素是体外诱导人MSCs分化成软骨细胞所必需的。DEX能够直接与糖皮质激素受体结合，上调聚集蛋白聚糖、皮连蛋白及Ⅺ型胶原基因的表达，诱导MSCs向软骨细胞分化，并且能够加强的作用。

一些其他的生物活性因子和化学药品也能促进MSC的成软骨分化，如骨形态发生蛋白(BMPs)、催乳素(PRL)、血管内皮生长因子(VEGF)、脯氨酸、丙酮酸钠等都已被证实具有有效提升MSCs分化成软骨细胞的能力。

脐带间充质干细胞的成软骨分化是一个多因素控制的过程，需要优化多种组分比例。现有诱导技术诱导分化率比较低，时间周期长，需要14～28天左右才能形成软骨，而且不能有效地使所有间充质干细胞都分化为软骨细胞，从而导致诱导后的软骨密度低，不够致密，软骨品质差，去分化速度快，不利于以后在组织工程中的使用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容