[发明专利]一种靶向CD22的嵌合抗原受体方法及用途

说明书

本发明涉及靶向CD22的嵌合抗原受体逆转录病毒的生产流程及其用途。具体而言，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：(1)含有依次连接的人的CD8抗原的前导肽、抗CD22单链抗体、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、人4‑1BB胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白；和(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白。本发明还提供包装逆转录病毒的过程，以及产毒细胞株的生产过程和筛选单克隆细胞株的过程。本发明成功制备了表达CD22‑4‑1BBz CAR的种子细胞库，为批量生产靶向CD22逆转录病毒奠定了基础。

技术领域

本发明属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向CD22的嵌合抗原受体逆转录病毒生产及其用途。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。

嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。

CD22广泛表达在B细胞前体的急性淋巴白血病(BCP-ALL)中，在研究的111病例数中有109例的原始细胞中都表达CD22抗原，表达率大于90％。Lars Nitschke报道CD22隶属于唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglecs,sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins)家族。这个家族的蛋白只在免疫系统的细胞中表达，所有自身免疫和获得性免疫系统里的细胞类型至少表达一种Siglecs家族蛋白。B细胞表达两个这个家族的成员，其中之一就是CD22，另外一个是Siglec-G。大部分Siglecs都带有酪氨酸免疫受体依赖的抑制结构(ITIMs，immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs)，对免疫进行负调节。ITIMs上的酪氨酸经过Src家族蛋白激酶磷酸化后，产生了一些含有SH2(Src homology2)结构域分子的结合位点。SHP1(SHP，SH2-domain containing protein tyrosinephosphatase)和SHP2最为重要的SH2结构域含有蛋白，这些蛋白被招募到含有ITIMs的受体后，会引起细胞内物质的去磷酸化及抑制好几条信号通路。比如CD22就是通过将SHP-1招募至自身的ITIMs从而抑制正常B细胞的BCR(B细胞受体，B-cell receptor)引起的钙离子信号通路。CD22结合带有α2-6偶联唾液酸的配体。这种结合直接的调节着CD22和BCR的结合从而调控CD22的抑制功能，可以调控B细胞的迁移及BCR信号的阈值。Nitscheke报道CD22长度是140kDa，拥有七个免疫球蛋白样结构域，特异性的表达于B细胞系，从前B细胞(pre-Bcell)时期开始表达。CD22存在于B细胞的各个时期，包括激活的B细胞和记忆B细胞；不过在终端分化的浆细胞中缺失表达。CD22在B细胞发展中的广谱表达，使其成为一个极具吸引力的靶向B细胞的分子。