[发明专利]一种副粘病毒的拯救系统和副粘病毒拯救方法

说明书

本发明提供了一种副粘病毒拯救方法，包括以下步骤：(1)将副粘病毒基因组质粒、N质粒、P质粒、L质粒、pT7‑T7RNAP质粒、pCDIBP‑T7RNAP质粒和动物细胞混合；(2)使用物理或化学方法介导多质粒共转染；(3)培养细胞；(4)收集病毒。所述pT7‑T7RNAP质粒是带有T7启动子和T7RNA聚合酶DNA序列的质粒；所述pCDIBP‑T7RNAP质粒是带有CMV启动子和T7RNA聚合酶DNA序列的质粒。本发明可以高效拯救出副粘病毒，并且能够适用于人用副粘病毒减毒活疫苗的生产。

技术领域

本发明涉及病毒反向遗传学领域，特别涉及一种副粘病毒的拯救系统和方法。

背景技术

副粘病毒是与粘液蛋白有特殊亲和性的一类病毒，其中麻疹、呼吸道合胞、新城疫病毒等可感染人或动物，人们通常用减毒活疫苗对副粘病毒感染进行预防。减毒活疫苗是指病原体经过各种处理后，发生变异，毒性减弱，但仍保留其免疫原性的毒株。

副粘病毒是一种负链RNA病毒。RNA病毒的反向遗传学,是采用病毒的遗传材料，在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质。采用反向遗传学系统不需要经过传统毒株的变异筛选即可拯救获得活疫苗中的活性成分病毒减毒株。

与正链RNA病毒相比，负链RNA病毒裸露的基因组或由cDNA转录所得的RNA无感染性，需与核衣壳蛋白，RNA依赖型RNA聚合酶等形成核糖核蛋白复合物，才能开始正常的复制和组装。因此，利用反向遗传学系统拯救副粘病毒，需共转染含病毒全长cDNA的质粒和表达病毒N、P、L蛋白的辅助质粒，其中N蛋白也称NP蛋白。T7RNA聚合酶，是一种高度特异识别T7启动子序列的DNA依赖的5'→3'RNA聚合酶。由于T7RNA聚合酶启动转录效率相对较强且具有严格的启动子识别特异性，所以基于T7RNA聚合酶的病毒拯救系统应用非常广泛，特别是对于一些基因组比较大的病毒，该系统更是具有不可替代的优势。

副粘病毒反向遗传学系统的建立过程中，通常将病毒株全长cDNA与编码蛋白N、P、L的基因克隆在T7启动子控制的质粒上，将全长质粒及辅助质粒共转染宿主细胞，质粒需在T7RNA聚合酶的作用下进行转录完成病毒的拯救。T7RNA聚合酶通常通过转染可表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒或能稳定表达T7RNA聚合酶的工程化细胞提供。

将重组痘病毒转入T7RNA聚合酶获得的工程化细胞用于疫苗生产，后期纯化时无法彻底去除重组痘病毒，无法满足GMP对病毒候选疫苗临床应用的要求，因此采用该方法拯救所得病毒不能用于疫苗的开发和生产。此外，相对于拯救病毒，重组痘病毒具有相对快速的细胞病变效应，使感染细胞快速产生CPE，缩短了目的病毒拯救及扩增的时间，影响拯救效率。

可持续表达T7RNA聚合酶的工程化细胞拯救重组病毒无需引入重组痘病毒，但在使用过程中也受到一定的限制。一方面，构建并维持能稳定表达T7RNA聚合酶工程细胞存在一定的难度；另一方面，构建所得的工程化细胞基因组序列在原有细胞基础上有插入，为保证疫苗临床应用的安全性，将工程化细胞应用到疫苗的开发、生产过程中需要经过验证，验证工程化细胞并将其用于疫苗的生产难度较大。因此，对于需要在人类身上进行临床试验进行评估的候选疫苗的开发，在其病毒株的生产过程中使用能表达T7RNA聚合酶的病毒或工程化细胞，都会使得整个疫苗从开发到临床应用过程复杂化，加大批准难度。

疫苗生产一个非常重要的因素是疫苗终产品的安全性和免疫原性，所有用于疫苗生产的基质必须完全避免隐藏未知病原体的污染而原代细胞基质很难避免这种污染。传统而经典的细胞基质例如鸡胚成纤维细胞作为病毒疫苗的生产能力有限，其他细胞基质例如CHO，MRC-5，WI-38，HEK 293，Vero，EB66细胞可作为疫苗安全生产的细胞系。Vero细胞作为可用于疫苗生产的细胞系，已被批准用于多种病毒疫苗的生产，如口服脊髓灰质炎减毒活疫苗、轮状病毒减毒活疫苗、将黄病毒YFV17D的膜蛋白替换为日本脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白的嵌合减毒活疫苗Imojev疫苗等。