[发明专利]一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体

权利要求书

1.一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：

（1）从感染大口黑鲈弹状病毒的大口黑鲈鱼苗中分离培养获得大口黑鲈弹状病毒；

（2）对大口黑鲈弹状病毒进行灭活；

（3）以灭活的大口黑鲈弹状病毒为抗原对180-190日龄的产蛋鸡进行免疫，收集免疫后产蛋鸡的鸡蛋，从鸡蛋的卵黄中提取纯化卵黄抗体；

步骤（1）从感染大口黑鲈弹状病毒的大口黑鲈中分离培养获得大口黑鲈弹状病毒具体操作如下：

①取感染MSRV的大口黑鲈鱼苗，匀浆后冻融2次，离心，取上清，经0.25μm的细菌过滤器过滤，滤液即为病毒粗提液；

②采用草鱼卵巢细胞株CO细胞作为大口黑鲈弹状病毒的敏感细胞，CO细胞培养基为M199完全培养基；待CO细胞在细胞汇合度达60-80%时，吸出培养基，加入M199基础培养基和病毒粗提液的混合液，覆盖至单层细胞表面，吸附1.5-2小时后，吸出未吸附病毒粗提液，添加M199维持液继续培养48-72小时，出现细胞病变50%以上，收获病毒液，并置于-80℃保存备用；M199完全培养基为M199基础培养基中添加10%胎牛血清，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素； M199维持液为M199基础培养基中添加3%胎牛血清，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素；

步骤（2）对大口黑鲈弹状病毒进行灭活具体操作如下：病毒液经离心，上清分装至无菌离心管中，加入福尔马林使终浓度为0.5%，盖紧管口；置65℃水浴锅中，待离心管中温度达65℃时开始计时，灭活2小时，每30min摇匀一次；灭活后冷却至室温，加入青霉素和链霉素，封口，置4℃保存；加入青霉素和链霉素的终浓度均为100ug/mL；

步骤（3）以灭活的大口黑鲈弹状病毒为抗原对产蛋鸡进行免疫具体操作为：将灭活的大口黑鲈弹状病毒与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂按1:1体积比混合，完全乳化后得弗氏完全佐剂乳化疫苗、弗氏不完全佐剂乳化疫苗；采用胸肌多点注射的方式，第一次以弗氏完全佐剂乳化疫苗免疫产蛋鸡，其它以弗氏不完全佐剂乳化疫苗免疫产蛋鸡，共免疫四次；四次免疫的时间为1d、7 d、14 d和28 d，每次免疫1mL/只。

2.根据权利要求1所述的一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于：从鸡蛋的卵黄中提取纯化卵黄抗体具体操作为：采用75%酒精对收集的鸡蛋进行表面消毒，在无菌条件下破壳，将蛋清倒出后，将蛋黄倒入无菌烧杯中，加入乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌10min，4℃沉淀过夜，吸取上清，离心，收集上清，加入饱和硫酸铵直至液体中出现沉淀，离心收集沉淀，沉淀超纯水重悬，透析除去硫酸铵，得卵黄抗体。

3.根据权利要求2所述的一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于：乙酸-乙酸钠缓冲液用量为每克蛋黄使用8mL，乙酸-乙酸钠缓冲液的pH为5.2，浓度0.12mol/L。